Efeito de vesículas extracelulares sobre osteoblastos expostos à  medicamentos antirreabsortivos

A osteonecrose dos maxilares induzida por medicamentos é uma condição debilitante e de difícil resolução clínica, caracterizada pela presença de osso exposto na região maxilofacial por pelo menos 8 semanas. O uso de vesículas extracelulares (VEs) derivadas de células-tronco da polpa dental (DPSC) surge como uma modalidade terapêutica promissora, dado que essas partículas têm capacidade de regular a angiogênese e osteogênese além de apresentarem baixa imunogenicidade. O objetivo deste estudo foi caracterizar VEs derivadas de DPSC e avaliar seu potencial terapêutico sobre osteoblastos expostos ao ácido zoledrônico (AZ) e/ou denosumabe (D). DPSCs foram isoladas da polpa de 5 dentes de 3 pacientes e caracterizadas com marcadores positivos (CD73, CD90 e CD105) e negativos (CD45 e CD34) para células-tronco por citometria de fluxo. VEs derivadas de DPCSs foram isoladas por ultracentrifugação e caracterizadas por rastreamento de partículas (NTA), citometria de fluxo, quantificação de proteínas, microscopia de força atômica (AFM), espalhamento de luz dinâmico (DLS), potencial zeta, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e capacidade de internalização por osteoblastos. Foram estabelecidos 8 grupos: controle (CN), AZ (5 μM), D (40 μg/mL), AZ+D, e os respectivos grupos tratados com VEs (10 µg/mL). Osteoblastos humanos (SAOS-2) foram semeados em placas de 96 compartimentos (8 × 10³ células/compartimento) em meio DMEM com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após 24 h, as células foram expostas aos medicamentos por 48 h, seguidas de tratamento com VEs ou meio sem SFB por 24 h. Posteriormente, as células foram mantidas em meio osteogênico por 48 h, e então foram realizados ensaios de viabilidade celular (VC, AlamarBlue, n=8), síntese de proteína total (PT, n=8), atividade de fosfatase alcalina (ALP, n=8), formação de nódulos mineralizados (NM, n=6), sobrevivência celular (Live or dead, n=2) e adesão celular (Actin Red, n=2) por fluorescência e expressão gênica de ALP, COL1A1 e TGFB1 (qPCR, n=4). Os dados foram submetidos a análise de variância ANOVA One-way, α=5%. Também foi investigada a inativação da via NFk- pelas VEs pelos osteoblastos. As DPSCs apresentaram marcação positiva para células-tronco acima de 93% e abaixo de 2% para os marcadores negativos. As VEs isoladas foram compostas majoritariamente por microvesículas com um tamanho modal de 92,3 nm, morfologia arredondada e presença de marcadores CD9, CD63 e CD81, específicos para VEs. Os osteoblastos demonstraram eficiente capacidade de internalização de VEs após 24 h de exposição às mesmas. Os tratamentos com AZ e AZ+D comprometeram todas as funções celulares, observados através da redução da VC, PT, ALP, NM sobrevivência, adesão celular e reduzida expressão dos genes avaliados. Os grupos tratados com D apresentaram metabolismo celular semelhante ao grupo controle. O tratamento com VEs foi capaz de reverter parcialmente a redução da atividade de ALP no grupo tratado com AZ e aumentar a produção de NM no grupo tratado com AZ+D (p < 0,05), além de reduzir a ativação da via NF-kB nos grupos tratados com AZ e AZ+D. Adicionalmente, as VEs aumentaram a expressão gênica de ALP e COL1A1. As VEs derivadas de DPSCs apresentam um potencial terapêutico de osteoblastos tratados com AZ.

Resumo (inglês)

Medication-related osteonecrosis of the jaw, induced by drugs is a debilitating condition with challenging clinical management, characterized by the presence of exposed bone in the maxillofacial region for at least 8 weeks. The use of extracellular vesicles (EVs) derived from dental pulp stem cells (DPSCs) has emerged as a promising therapeutic approach, as these particles can regulate angiogenesis and osteogenesis and exhibit low immunogenicity. The aim of this study was to characterize (EVs) derived DPSCs and investigate their therapeutic potential in osteoblasts exposed to zoledronic acid (ZA) and/or denosumab (D). DPSCs were isolated from the pulp of 5 teeth from 3 patients and characterized by positive stem cell markers (CD73, CD90, and CD105) and negative markers (CD45 and CD34) using flow cytometry. EVs derived from DPSCs were isolated by ultracentrifugation and characterized by nanoparticle tracking analysis (NTA), flow cytometry, protein quantification, atomic force microscopy (AFM), dynamic light scattering (DLS), zeta potential, scanning electron microscopy (SEM), and EV internalization by osteoblasts. Eight groups were established: control (CN), ZA (5 μM), D (40 μg/mL), ZA+D, and their respective groups treated with EVs (10 µg/mL). Human osteoblasts (SAOS-2) were seeded in 96-well plates (8 × 10³ cells/well) in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS). After 24 hours, the cells were exposed to the drugs for 48 hours, followed by treatment with EVs or serum-free medium for 24 hours. Subsequently, the cells were maintained in osteogenic medium for 48 hours. Cell viability (CV, AlamarBlue, n=8), total protein synthesis (TP, n=8), alkaline phosphatase activity (ALP, n=8), mineralized nodule formation (MN, n=6), cell survival (Live or Dead assay, n=2), and cell adhesion (Actin Red, n=2) were evaluated by fluorescence and the gene expression of ALP, COL1A1 and TGFB1 (qPCR, n=4). Data were analyzed using one way ANOVA, with α = 5%. The inactivation of the NFk-β pathway by EVs was also evaluated in osteoblasts. DPSCs showed over 93% positivity for stem cell markers and less than 2% for negative markers. The isolated EVs consisted predominantly of microvesicles with a modal size of 92.3 nm, rounded morphology, and the presence of CD9, CD63, and CD81, EV-specific markers. Osteoblasts demonstrated efficiency in their capacity to internalize EVs after 24 hours of exposure to them. Treatments with ZA and ZA+D compromised all cellular functions, observed through reductions in CV, TP, ALP, MN, cell survival and cell adhesion and reduction in expression of the evaluated genes. The groups treated with D exhibited cellular metabolism comparable to the control group. Treatment with EVs was able to partially reverse the reduction in ALP activity in the ZA-treated group and increase MN production in the ZA+D-treated group (p < 0.05), in addition to decreasing activation of the NF-κB pathway in the ZA and ZA+D-treated group. In addition, EVs increased ALP e COL1A1 gene expression. EVs derived from DPSCs exhibit therapeutic potential for AZ-treated osteoblasts.

Palavras-chave

Vesículas extracelulares Osteoblastos Ácido zoledrônico Denosumab Extracellular vesicles Osteoblasts Zoledronic acid Denosumab

Idioma

Português

Citação

Deróbio HO. Efeito de vesículas extracelulares sobre osteoblastos expostos à medicamentos antirreabsortivos [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2026.