Investigação dos mecanismos moleculares da regeneração tecidual em zebrafish (Danio rerio)

A regeneração epimórfica é um fenômeno biológico fascinante no qual partes do corpo perdidas são reconstruídas por meio da formação de um blastema, recapitulando eventos do desenvolvimento. Apesar do conhecimento sobre a participação de migração, desdiferenciação e proliferação de células ósseas nesse processo, muitos dos mecanismos moleculares subjacentes permanecem desconhecidos. Para investigar isso, o zebrafish (Danio rerio), conhecido por sua notável capacidade de regenerar nadadeiras, tem sido amplamente utilizado como organismo modelo. Além disso, o papel dos miRNAs, que ajustam a expressão gênica em diversos processos biológicos, na desdiferenciação celular é pouco compreendido. Neste trabalho utilizamos duas abordagens para contribuir para o entendimento dos mecanismos moleculares subjacentes à regulação da regeneração tecidual da nadadeira caudal no modelo zebrafish. No primeiro capítulo apresentamos a a abordagem da edição gênica por CRISPR/cas9 para gerar linhagens mutantes com knockout dos genes sp7 e runx2a. Das linhagens geradas, apenas quatro linhagens de runx2a apresentaram potencial de alteração nas proteínas correspondentes. As mutações da linhagem sp7 não estão localizadas em regiões codificantes do gene. Adicionados a esses mutantes, selecionamos também peixes com Superexpressão do gene gh e realizamos testes de regeneração. A partir da medição da área regenerada 72 horas após a amputação da nadadeira caudal, pudemos constatar que apenas os mutantes sp7- apresentaram crescimento menor com diferença estatista significativa quando comparados com peixes do tipo selvagem. com os conhecimentos. No segundo capítulo apresentamos nossa abordagem mais abrangente em busca de genes e miRNAs que pudessem regular os eventos moleculares da regeneração. Para isso, realizamos a amputação da nadadeira caudal e coletamos tecidos de 50 zebrafish, subdivididos em 6 grupos experimentais: 0, 12, 24, 36, 48, 72 horas pós-amputação (hpa). Essas amostras foram subdividas e utilizadas para o sequenciamento em larga escala de mRNAs dos períodos 0, 12, 24, 48 e 72 hpa. A partir dos dados de RNA-seq, verificamos uma similaridade entre as amostras coletadas em 48 e 72 hpa, de maneira que a comparação entre esses grupos retornou menor número de elementos diferencialmente expressos, enquanto grupos mais distintos como 12 e 0 hpa apresentaram um quantitativo superior de elementos diferencialmente expressos. O enriquecimento funcional dos elementos xi diferencialmente expressos apontou um grande número de bioprocessos acontecendo durante a regeneração, incluindo processos ligados ao desenvolvimento ósseo e embrionário, apontando para a possibilidade da regeneração recapitular eventos da ontogênese. Dentre esses termos enriquecidos identificamos genes conhecidos por seu envolvimento em vias de regeneração como runx1 e wnt. Quanto ao sequenciamento profundo de miRNAs, o DESeq2 foi utilizado para análise de expressão diferencial (DE), com significância definida em valor p ajustado <0,05 e um log2 fold change >2 ou <-2. Nossa análise produziu 116.446.596 leituras de prémiRNA. Comparando os diferentes grupos com o controle em 0 hpa, identificamos vários miRNAs DE em cada ponto de tempo. Notavelmente, sete miRNAs (dre-miR21-3p, dre-miR-21-5p, dre-miR-21-3p-2, dre-miR-21-5p-2, dre-miR-21-3p-3, dre-miR29-5p-3 e um novo miRNA dre-miR-n10856-3p) foram consistentemente DE em todos os grupos, sugerindo sua potencial importância no processo de desdiferenciação celular. Investigação adicional revelou que 74 miRNAs foram DE às 12 hpa, com apenas 17 sendo compartilhados com outros pontos de tempo, enquanto 57 miRNAs foram exclusivamente DE às 12 hpa. Esse achado sugere a presença de eventos moleculares significativos regulados especificamente nessa fase inicial de regeneração, muitos relacionados à desdiferenciação. À medida que avançamos para as fases posteriores da regeneração, com aumento da proliferação celular às 48 e 72 hpa, o número de miRNAs DE diminui, com seis miRNAs compartilhados entre esses momentos. Ao final, identificamos potenciais alvos regulados pelos miRNAs DE e usamos enriquecimento funcional para descobrir processos envolvidos na regeneração epimórfica na nadadeira caudal de zebrafish. Embora nossos resultados não sejam conclusivos ainda, estes apontam para a complexidade envolvida no processo de regeneração óssea, com miRNAs regulando diversos alvos com a mesma função 3 biológica e também outras formas de regulação que não apenas os miRNAs, mas também a interação entre os genes do desenvolvimento ósseo como a interação entre os genes estudados.

Resumo (inglês)

Epimorphic regeneration is a fascinating biological phenomenon in which lost body parts are reconstructed through the formation of a blastema, recapitulating developmental events. Despite the knowledge of the involvement of migration, dedifferentiation, and proliferation of bone cells in this process, many of the underlying molecular mechanisms remain unknown. To investigate this, zebrafish (Danio rerio), known for its remarkable ability to regenerate fins, has been extensively used as a model organism. Additionally, the role of miRNAs, which fine-tune gene expression in various biological processes, in cell dedifferentiation is poorly understood. In this work, we used two approaches to contribute to the understanding of the molecular mechanisms underlying the regulation of tissue regeneration in the caudal fin of the zebrafish model. In the first chapter, we present the gene-editing approach using CRISPR/Cas9 to generate mutant lineages with knockouts of the sp7 and runx2a genes. Of the generated lineages, only four runx2a lineages showed potential for alteration in the corresponding proteins. The mutations in the sp7 lineages are not located in coding regions of the gene. In addition to these mutants, we also selected fish with overexpression of the gh gene and conducted regeneration tests. Based on the measurement of the regenerated area 72 hours after amputation of the caudal fin, we found that only the sp7- mutants showed statistically significant reduced growth when compared to wild-type fish. In the second chapter, we present our more comprehensive approach in search of genes and miRNAs that could regulate the molecular events of regeneration. For this, we performed caudal fin amputation and collected tissues from 50 zebrafish, subdivided into 6 experimental groups: 0, 12, 24, 36, 48, 72 hours post-amputation (hpa). These samples were subdivided and used for large-scale mRNA and miRNA sequencing at 0, 12, 24, 48, and 72 hpa. From the RNA-seq data, we observed a similarity between the samples collected at 48 and 72 hpa, so that the comparison between these groups returned fewer differentially expressed elements, while more distinct groups such as 12 and 0 hpa showed a greater number of differentially expressed elements. The functional enrichment of differentially expressed elements pointed to a large number of bioprocesses occurring during regeneration, including processes related to bone and embryonic development, suggesting the possibility of regeneration recapitulating ontogeny events. Among these enriched terms, we identified genes known for their involvement in regeneration pathways such as runx1 and wnt. For deep miRNA sequencing, DESeq2 was used for differential expression (DE) analysis, with significance defined at p adjusted value <0.05 and a log2 fold change >2 or <-2. Our analysis produced 116,446,596 pre-miRNA reads. Comparing the different groups with the control at 0 hpa, we identified several DE miRNAs at each time point. Notably, seven miRNAs (dre-miR-21-3p, dre-miR-21-5p, dre-miR-21-3p-2, dre-miR-21-5p-2, dre-miR-21-3p-3, dre-miR-29-5p-3, and a novel miRNA dre-miR-n10856-3p) were consistently DE in all groups, suggesting their potential importance in the cell dedifferentiation process. Further investigation revealed that 74 miRNAs were DE at 12 hpa, with only 17 shared with other time points, while 57 miRNAs were exclusively DE at 12 hpa. This finding suggests the presence of significant molecular events regulated specifically at this early stage of regeneration, many related to dedifferentiation. As we move into the later stages of regeneration, with increased cell proliferation at 48 and 72 hpa, the number of DE miRNAs decreases, with six miRNAs shared between these time points. In the end, we identified potential targets regulated by DE miRNAs and used functional enrichment to uncover processes involved in epimorphic regeneration in the zebrafish caudal fin. Although our results are not yet conclusive, they point to the complexity involved in the bone regeneration process, with miRNAs regulating multiple targets with the same biological function, as well as other forms of regulation not only by miRNAs but also through interaction between bone development genes, such as the interaction between the studied genes.

Palavras-chave

Sequenciamento de nucleotídeo, Regeneração óssea, Proteína 9 associada à CRISPR, Peixe-zebra

Idioma

Português

Citação

PEREIRA, Beatriz Jacinto Alves. Investigação dos mecanismos moleculares da regeneração tecidual em zebrafish (Danio rerio). 2026. Orientador: Danillo Pinhal. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas - Genética) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, 2024.