Busca de ligantes peptídicos para modulação de atividades da toxina exfoliativa C (ExhC) de Mammaliicoccus sciuri

Abstract

Mammaliicoccus sciuri é uma bactéria (família Staphylococcaceae) patogênica e comensal. É o agente etiológico da epidermite exsudativa em suínos principalmente por causa da toxina exfoliativa C (ExhC). A ExhC de M. sciuri também causa exfoliação epidérmica em ratos recém-nascidos, necrose em fibroblastos renais de hamsters recém-nascidos (BHK-21), e inibição da ação fagocitária por macrófagos RAW 264.7. Essas duas últimas propriedades são até o momento desconhecidas para as demais toxinas exfoliativas (ETs) produzidas por bactérias do gênero Staphylococcus. Recentemente, a produção de fragmentos recombinantes da ExhC permitiu concluir que interações específicas no domínio contendo certos resíduos de aminoácidos são responsáveis pela atividade necrótica. O objetivo principal é encontrar ligantes peptídicos, através da técnica Phage Display, que possam inibir as diferentes atividades da ExhC, além da busca por meio da ferramenta BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) de proteínas celulares parceiras envolvidas nestes efeitos, favorecendo a compreensão dos mecanismos de ação. A primeira etapa da purificação (afinidade) gerou uma amostra com alto grau de pureza, com exceção de um contaminante de peso molecular superior ao da proteína de interesse. A segunda etapa da purificação eliminou o contaminante, além de gerar uma amostra com um único estado oligomérico. O rendimento da proteína foi de aproximadamente 10 mg/L de cultura. O gel de poliacrilamida com amostras da purificação por níquel e por exclusão de tamanho foi utilizado para mostrar as etapas de purificação. A proteína apresentou atividade catalítica mantida, comparado a estudos anteriores. O Phage Display identificou 73 peptídeos contra ExhC Selvagem e 49 peptídeos contra ExhC Mutante (sítio necrótico). 6 peptídeos foram selecionados considerando o hospedeiro e função da proteína parceira, além da posição em superfície e forma do peptídeo. Os resultados deste trabalho demonstram sucesso nos processos de transformação, expressão e purificação da proteína ExhC. Os ensaios de MTT com a ExhC em linhagem BHK-21 confirmaram que a necrose celular causada por ExhC de M. sciuri é dependente não apenas da concentração dessa proteína, mas também do tempo de incubação celular. Nos ensaios de atividade exfoliativa não se observou modulação para os peptídeos testados. Contudo, os primeiros resultados dos ensaios celulares com células BHK-21 sugerem modulação da atividade necrótica da ExhC quando certos peptídeos estão presentes.

Mammaliicoccus sciuri is a pathogenic and commensal bacterium (family Staphylococcaceae). It is the etiological agent of exudative epidermitis in pigs mainly due to exfoliative toxin C (ExhC). ExhC from M. sciuri also causes epidermal exfoliation in newborn rats, necrosis in newborn hamster kidney fibroblasts (BHK-21), and inhibition of phagocytic action by RAW 264.7 macrophages. These last two properties are currently unknown for other exfoliative toxins (ETs) produced by bacteria of the genus Staphylococcus. Recently, the production of recombinant ExhC fragments allowed us to conclude that specific interactions in the domain containing certain amino acid residues are responsible for the necrotic activity. The main objective is to find peptide ligands, using the Phage Display technique, that can inhibit the different activities of ExhC, in addition to searching using the BLAST tool (Basic Local Alignment Search Tool) for partner cellular proteins involved in these effects, favoring the understanding of the mechanisms of action. The first stage of purification (affinity) generated a sample with a high degree of purity, with the exception of a contaminant with a molecular weight higher than that of the protein of interest. The second purification step eliminated the contaminant, in addition to generating a sample with a single oligomeric state. The protein yield was approximately 10 mg/L of culture. The polyacrylamide gel with samples from nickel and size exclusion purification was used to show the purification steps. The protein showed maintained catalytic activity, compared to previous studies. Phage Display identified 73 peptides against Wild ExhC and 49 peptides against Mutant ExhC (necrotic site). 6 peptides were selected considering the host and function of the partner protein, in addition to the surface position and shape of the peptide. The results of this work demonstrate success in the transformation, expression and purification processes of the ExhC protein. MTT assays with ExhC in strain BHK-21 confirmed that cellular necrosis caused by ExhC of M. sciuri is dependent not only on the concentration of this protein, but also on the cell incubation time. In the exfoliative activity tests, no modulation was observed for the peptides tested. However, the first results from cellular assays with BHK-21 cells suggest modulation of the necrotic activity of ExhC when certain peptides are present.