Engenharia de tecidos em vasos sanguíneos: modelo em coelhos - in vitro
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Autores
Orientador
Coorientador
Pós-graduação
Cirurgia e Medicina Translacional - FMB
Curso de graduação
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Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Introdução: As doenças cardiovasculares são as principais responsáveis pela mortalidade da população ocidental, sendo que a doença arterial obstrutiva periférica (DAOP) representa 5% desse contingente. Pacientes sintomáticos possuem rápida evolução do quadro clínico quando tratados inadequadamente, sendo que cerca de 25% passam por amputação do membro inferior acometido. Com isso, pesquisas recentes vêm mostrando um futuro promissor na terapia regenerativa e substitutiva de tecidos envolvendo células-tronco mesenquimais (CTM) e engenharia celular, incluindo a engenharia de tecidos em vasos sanguíneos (tissue-engineered blood vessels – TEBV). Objetivo: Aprimorar as técnicas de TEBV a partir de modelo animal (coelhos), in vitro, a partir da diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo (ASC) em endotélio e músculo liso. Métodos: Veias cavas inferiores (VCI) foram obtidas de 30 coelhos fêmeas, não prenhas, para proceder a descelularização e servirem de scaffold. Cada VCI foi fragmentada em segmentos de 2cm e a descelularização foi realizada por meio de protocolos estabelecidos com Dodecil sulfato de sódio 1% (SDS) por 2h. Para obtenção das ASCs, tecido adiposo (TA) interescapular foi obtido dos mesmos animais doadores das veias cavas inferiores. Após a dissociação enzimática do TA e a expansão da cultura das ASCs em número necessário, estas foram aplicadas na luz dos scaffolds 3D com Puramatrix®, sendo mantidos em placas de cultura de 24 poços, individualmente. Para indução da diferenciação endotelial das células aderidas ao arcabouço, o meio de cultura DMEM foi suplementado com VEGF (50ng/mL), FGF (20ng/mL), IGF (20ng/mL) e GF (20ng/mL), e mantidas por 2, 4 e 8 semanas em cultura. Por análise histopatológica determinou-se o melhor protocolo. A seguir, fez-se a acreção de músculo liso pré-diferenciado por 4 semanas (DMEM+ BMP4 2,5ng/mL e TGF-1 5ng/mL) também com uso de Puramatrix®. Observou-se os resultados histológicos em 2 e 4 semanas e escolheu-se o melhor protocolo. A partir desse resultado, fez-se a quantificação de citocinas no meio de cultura e quantificação da expressão de miRNAs nos neovasos (em triplicata). Resultados: No experimento de endotelização do scaffold, obtivemos uma melhor distribuição celular tempo-benefício para o tempo de 4 semanas. Em sequência, na adesão de músculo liso, observou-se melhores resultados também em 4 semanas de co-cultura. Análises por HE, imunohistoquímica e imunofluorescência comprovaram a diferenciação celular endotelial e músculo liso. Técnica de miRNAs puderam revelar algumas das vias genéticas envolvidas na TEBV, principalmente no que tange a imaturidade celular. Conclusão: O modelo biológico de scaffold de veia cava inferior descelularizado e recelularizado, in vitro, demonstrou boa celularização e diferenciação celular. As técnicas histológicas, análises de citocinas e do perfil global de expressão de miRNAs sugerem que os resultados são promissores para futuro uso da TEBV em modelo in vivo.
Resumo (inglês)
Background: Background: Cardiovascular diseases are the main cause of mortality in the Western population, with peripheral arterial disease (PAD) accounting for 5% of this population. Symptomatic patients have a rapid evolution of the clinical condition when inadequately treated, and about 25% undergo amputation of the affected lower limb. As a result, recent research has shown a promising future in regenerative and tissue replacement therapy involving mesenchymal stem cells (MSC) and cell engineering, including tissue-engineered blood vessels (TEBV) engineering. Objective: To improve TEBV techniques from an animal model (rabbits), in vitro, from the differentiation of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue (ASC) into endothelium and smooth muscle. Methods: Inferior vena cava (IVC) were obtained from 30 female rabbits, not pregnant, to proceed with decellularization and serve as a scaffold. Each IVC was fragmented into 2cm segments and decellularization was performed using established protocols with 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) for 2h. To obtain the ASCs, interscapular adipose tissue (AT) was obtained from the same donor animals of the inferior vena cava. After the enzymatic dissociation of the TA and the expansion of the culture of the ASCs in the necessary number, these were applied in the light of the 3D scaffolds with Puramatrix®, being maintained in culture plates of 24 wells, individually. To induce endothelial differentiation of cells adhered to the scaffold, the DMEM culture medium was supplemented with VEGF (50ng/mL), FGF (20ng/mL), IGF (20ng/mL), and GF (20ng/mL), and maintained for 2, 4 and 8 weeks in culture. By histopathological analysis, the best protocol was determined. Next, pre-differentiated smooth muscle accretion was performed for 4 weeks (DMEM+ BMP4 2.5ng/mL and TGF-1 5ng/mL) also using Puramatrix®. Histological results were observed at 2 and 4 weeks and the best protocol was chosen. Based on this result, the quantification of cytokines in the culture medium and the quantification of the expression of miRNAs in the neovessels (in triplicate). Results: In the scaffold endothelialization experiment, we obtained a better time-benefit cellular distribution for the 4-week period. In sequence, in smooth muscle adhesion, better results were also observed in 4 weeks of co-culture. Analysis by HE, immunohistochemistry, and immunofluorescence confirmed endothelial and smooth muscle cell differentiation. miRNAs technique could reveal some of the genetic pathways involved in TEBV, mainly with regard to cellular immaturity. Conclusion: The biological model of decellularized and recellularized inferior vena cava scaffold, in vitro, demonstrated good cellularization and cell differentiation. Histological techniques, cytokine analysis, and global miRNA expression profile suggest that the results are promising for future use of TEBV in an in vivo model.
Descrição
Idioma
Português
