Resistência a quimioterápicos no câncer e bioprospecção de epi-drugs: abordagem integrada de quimioinformática e desenvolvimento de modelo in vitro para testes funcionais

Apicultural products such as royal jelly and propolis are chemically complex and biologically active natural matrices with potential for the discovery of anticancer drugs. However, the intrinsic chemical variability of these natural products, influenced by climatic and environmental factors, poses challenges for standardization and for demonstrating therapeutic efficacy. This study aimed to investigate the potential of chemical constituents from apicultural products as candidate modulators of epigenetic machinery and, in parallel, to establish an experimental platform to study acquired chemoresistance in a colorectal cancer cell model. Integrated cheminformatics approaches were used to characterize potential epi-drug candidates among 32 fatty acids present in royal jelly and among the unique compounds detected across different propolis samples. In Chapter 1, computational simulations and experimental validation (in vitro enzymatic activity assays and gene expression analysis by RT–qPCR) in colorectal (HCT116) and breast (MDA-MB-231) cancer cell lines demonstrated that 10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) and 10-hydroxydecanoic acid (10-HDAA) act as weak inhibitors of histone deacetylases (HDACs). These results indicate that these compounds facilitate chromatin acetylation and modulate gene expression, mimicking, albeit in an attenuated manner, the mechanism of action of commercial drugs such as SAHA and TSA. In the propolis investigation (Chapter 2), a systematic review following PRISMA 2020 recommendations consolidated 1,322 unique small molecules, expanding knowledge of the global chemical space of this product and highlighting the contribution of Brazilian biodiversity. After the application of pharmacokinetic filters and the removal of assay interferents (PAINS), virtual screening (molecular docking) prioritized candidates as potential inhibitors of DNA methyltransferase 1 (DNMT1), identifying isovestitol and liquiritigenin as ligands with favorable affinity profiles. In Chapter 3, an in vitro model of acquired irinotecan resistance was developed through daily exposure of HCT116 cells to increasing doses of SN38 (7-ethyl-10-hydroxycamptothecin). Two subpopulations were selected based on exposure up to 60 nM (HCT116-SP60) and up to 80 nM (HCT116-SP80) SN38. Parental and derived subpopulations were used to determine SN38 IC50 values and to compare proliferative capacity (doubling time assessed by carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) staining and flow cytometry, as well as conventional colony formation). Cell migration was evaluated using the scratch assay. In addition, liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC–MS/MS)-based proteomics was performed for peptide identification and differential protein expression analysis using MetaboAnalyst. RT–qPCR was conducted to assess the expression levels of genes encoding key epigenetic enzymes, including HDACs and enhancer of zeste homolog 2 protein (EZH2). The IC50 values for parental cells, HCT116-SP60, and HCT116-SP80 were 0.07409 µM, 0.1838 µM, and 0.1665 µM, respectively. Doubling times for HCT116, HCT116-SP60, and HCT116-SP80 were 19.95 h (R = 0.958), 28.94 h (R = 0.871), and 21.20 h (R = 0.986), respectively. Both selected subpopulations exhibited reduced colony size (ANOVA, Dunnett, p < 0.05) and reduced migratory capacity (ANOVA, Bonferroni, p < 0.05). Proteomic analysis detected 351, 327, and 400 proteins in HCT116, HCT116-SP60, and HCT116-SP80, respectively. Functional enrichment analysis indicated involvement in fundamental processes such as transcription, RNA splicing, translation, amino acid metabolism, cell adhesion, and chromatin modulation. ANP32A was detected exclusively in HCT116-SP60 and HCT116-SP80. This protein, considered a tumor suppressor, has been previously reported to be associated with SET to form the INHAT complex, which inhibits histone acetylation. Class I histone deacetylase genes (HDAC1, HDAC2, and HDAC8) were downregulated in resistant subpopulations. Overall, this thesis demonstrates the plausibility of a functional axis between natural products and epigenetic regulation. By proposing specific molecular mechanisms of action, the study supports translation of scientific knowledge into potential practical applications for candidate epi-drugs. In addition, the in vitro resistance model developed suggests that histone-modifying enzymes are associated with SN38 resistance in HCT116 cells. These SN38-resistant cells will be used in future studies to investigate molecular resistance mechanisms and to test epigenetic priming and re-sensitization strategies.

Resumo (português)

Produtos apícolas como geleia real e própolis constituem matrizes naturais quimicamente complexas e biologicamente ativas, com potencial para a descoberta de drogas relevantes para o tratamento do câncer. No entanto, a variabilidade química intrínseca destes produtos naturais, influenciada por fatores climáticos e ambientais, impõe desafios à padronização e à comprovação de sua eficácia terapêutica. Este estudo teve como objetivo investigar o potencial de compostos químicos presentes em produtos apícolas como candidatos a moduladores da maquinaria epigenética e, em paralelo, estabelecer uma plataforma experimental para estudar resistência adquirida à quimioterapia em um modelo celular de câncer colorretal. Abordagens integragadas de quimioinformática foram utilizadas para a caracterização de potenciais epi-drugs entre 32 ácidos graxos presentes na geleia real ou entre os compostos únicos detectados em diferentes amostras de própolis. No capítulo 1, simulações computacionais e validações experimentais (determinação da atividade enzimática in vitro e expressão gênica por RT-qPCR) em linhagens de câncer colorretal (HCT116) e mama (MDA-MB-231) demonstraram que os ácidos 10-hidroxi-2-decenóico (10-HDA) e 10-hidroxidecanoico (10-HDAA) atuam como inibidores fracos de desacetilases de histonas (HDACs). Os resultados indicam que esses compostos facilitam a acetilação da cromatina e promovem a modulação da expressão gênica, mimetizando, ainda que de forma atenuada, o mecanismo de fármacos comerciais como SAHA e TSA. Na investigação da própolis (capítulo 2), realizou-se uma revisão sistemática, segundo recomendações do PRISMA 2020, que consolidou 1.322 pequenas moléculas únicas, expandindo o conhecimento sobre o espaço químico global deste produto, com destaque para a contribuição da biodiversidade brasileira. Após a aplicação de filtros de farmacocinética e remoção de interferentes (PAINS), a triagem virtual (docking molecular) priorizou candidatos que são potenciais inibidores da enzima DNA metiltransferase 1 (DNMT1), identificando o isovestitol e a liquiritigenina como ligantes com perfis de afinidade favoráveis. No Capítulo 3, foi desenvolvido um modelo in vitro de resistência adquirida ao irinotecano por exposição diária de células HCT116 a doses crescentes de SN38 (7-etil-10-hidroxicamptotecina). Duas subpopulações foram selecionadas com base na exposição a até 60 nM (HCT116-SP60) e a até 80 nM (HCT116-SP80) de SN38. As subpopulações parentais e as derivadas foram utilizadas para calcular a IC50 do SN38 e para comparar seu potencial proliferativo (tempo de duplicação usando coloração éster succinimidil de carboxifluoresceína (CFSE) e citometria de fluxo, bem como formação de colônias convencional). A migração celular foi avaliada utilizando o ensaio de cell scratch. Além disso, foi conduzida uma análise proteômica baseada em cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) para determinação de peptídeos e análise diferencial de expressão proteica utilizando a ferramenta MetaboAnalyst. A RT-qPCR foi realizada para avaliar os níveis de expressão de genes que codificam enzimas epigenéticas chave, HDACs e homólogo 2 do potenciador de zeste (EZH2). Os valores de IC50 para as células parentais, HCT116-SP60 e HCT116-SP80 foram 0,07409 µM, 0,1838 µM e 0,1665 µM, respectivamente. O tempo de duplicação para HCT-116, HCT116-SP60 e HCT116-SP80 foi de 19,95h (R = 0,958), 28,94h (R = 0,871) e 21,20h (R = 0,986), respectivamente. Ambas as subpopulações selecionadas exibiram tamanho de colônia reduzido (ANOVA, Dunnett, p<0,05) e capacidade de migração reduzida (ANOVA, Bonferroni, p<0,05). A análise proteômica detectou 351, 327 e 400 proteínas em HCT116, HCT116-SP60 e HCT116-SP80, respectivamente. A análise de enriquecimento funcional indicou envolvimento em processos básicos como transcrição, splicing de RNA, tradução, metabolismo de aminoácidos, adesão celular e modulação da cromatina. A proteína ANP32A foi encontrada exclusivamente na HCT116-SP60 e HCT116-SP80. Esta enzima, considerada supressora de tumor, foi previamente relatada como associada à SET para formar o complexo INHAT, que inibe a acetilação de histonas. Os genes codificadores de histona desacetilase de classe I (HDAC1, HDAC2 e HDAC8) foram regulados negativamente (downregulated) nas subpopulações resistentes. No geral, esta tese demonstra a plausibilidade de um eixo funcional entre produtos naturais e a regulação epigenética. Ao propor mecanismos de ação moleculares específicos, o estudo contribui para a translação do conhecimento científico em possíveis aplicações práticas das potenciais epi-drugs. Em adição, o modelo de resistência in vitro desenvolvido sugere que enzimas modificadoras de histonas estão associadas à resistência ao SN38 nas células HCT116. Estas células resistentes ao SN-38 serão posteriormente utilizadas em estudos futuros para investigar os mecanismos moleculares de resistência e testar estratégias de priming epigenético e re-sensibilização.

Palavras-chave

Epigenética, Abelha Produtos, Bioinformática, Drogas resistência em células cancerosas

Idioma

Português

Citação

FRANCE, Fernanda Aparecida dos Santos. Resistência a quimioterápicos no câncer e bioprospecção de epi-drugs: abordagem integrada de quimioinformática e desenvolvimento de modelo in vitro para testes funcionais. 2026. 189 f. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas (Genética)) – Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética), Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP), Botucatu, 2026. Orientadora: Claudia Aparecida Rainho.