Caracterização estrutural e proteômica da matriz extracelular testicular descelularizada de Astyanax lacustris e desenvolvimento de sistema de cultivo 3D de células germinativas para aplicações biotecnológicas

Abstract

O primeiro capítulo desta tese teve como objetivo desenvolver um protocolo de descelularização da matriz extracelular testicular (dtECM) derivada de peixe, utilizando Astyanax lacustris como modelo, por meio da combinação do detergente iônico dodecil sulfato de sódio (0,1% SDS) com métodos de agitação física. A remoção celular foi confirmada por análises histológicas e coloração com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), enquanto a preservação da matriz extracelular (ECM) foi avaliada por imunofluorescência, microscopia eletrônica de varredura (MEV), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e proteômica. O SDS foi eficaz na remoção das células, mantendo proteínas-chave da ECM, como Colágeno I, Fibronectina e Laminina α1. A microarquitetura testicular, incluindo a membrana basal e os túbulos seminíferos, permaneceu preservada. A proteômica revelou o enriquecimento de proteínas associadas à ECM e a depleção de proteínas relacionadas ao metabolismo celular. A dtECM manteve componentes essenciais do matrisoma, como diversos tipos de colágeno, fibronectina, laminina, heparam sulfato, integrinas, fatores secretados e reguladores da ECM. Esses achados indicam que a dtECM é um scaffold promissor para aplicações de cultura in vitro. Desta forma, estudos futuros são necessários para avaliar sua eficácia no suporte à proliferação e diferenciação das células germinativas de peixes in vitro, assim como, para padronizar a produção de hidrogéis derivados de dtECM. O segundo objetivo desta tese foi estabelecer protocolos para o desenvolvimento de esferoides testiculares 3D em A. lacustris utilizando um sistema de agregação celular forçada por centrifugação em micropoços. Os resultados demostraram que as células germinativas se agregaram espontaneamente, formando estruturas esferoidais, arredondadas e/ou irregulares, com diferentes diâmetros. No entanto, observou-se a completa desintegração dos esferoides após sete dias de cultivo. Para superar essas limitações, estudos futuros devem combinar a técnica de agregação forçada com um sistema de cultivo em interface ar-líquido, a fim de melhorar o suprimento de nutrientes e a troca gasosa, além de testar formulações de meio de cultura otimizadas para melhorar a estabilidade dos esferoides a longo prazo e apoiar o desenvolvimento de organoides testiculares. Essa abordagem poderá viabilizar aplicações biotecnológicas, como a produção in vitro de espermatozoides para espécies de peixes de interesse econômico, especialmente aquelas com ciclos prolongados de maturação sexual.

The first chapter of this thesis aimed to develop a decellularization protocol for testicular extracellular matrix (dtECM) derived from fish, using *Astyanax lacustris* as a model, through the combination of the ionic detergent sodium dodecyl sulfate (0.1% SDS) with physical agitation methods. Cellular removal was confirmed by histological analyses and 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, while preservation of the extracellular matrix (ECM) was evaluated by immunofluorescence, scanning electron microscopy (SEM), transmission electron microscopy (TEM), and proteomics. SDS effectively removed the cells while preserving key ECM proteins such as Collagen I, Fibronectin, and Laminin α1. The testicular microarchitecture, including the basement membrane and seminiferous tubules, remained preserved. Proteomic analysis revealed enrichment of ECM-associated proteins and depletion of proteins related to cellular metabolism. The dtECM retained essential matrisome components, including various types of collagen, fibronectin, laminin, heparan sulfate, integrins, secreted factors, and ECM regulators. These findings indicate that dtECM is a promising scaffold for in vitro culture applications. Therefore, future studies are needed to evaluate its effectiveness in supporting the proliferation and differentiation of germ cells from fish in vitro, as well as to standardize the production of hydrogels derived from dtECM. The second objective of this thesis was to establish protocols for the development of 3D testicular spheroids in *A. lacustris* using a forced cell aggregation system by centrifugation in microwells. The results showed that germ cells spontaneously aggregated, forming spheroidal, rounded, and/or irregular structures with varying diameters. However, complete disintegration of the spheroids was observed after seven days of culture. To overcome these limitations, future studies should combine the forced aggregation technique with an air-liquid interface culture system to improve nutrient supply and gas exchange, as well as test optimized culture medium formulations to enhance long-term spheroid stability and support testicular organoid development. This approach could enable biotechnological applications such as the in vitro production of spermatozoa for fish species of economic interest, especially those with prolonged sexual maturation cycles.