Proteômica do fluido folicular ovariano de ovelhas

Abstract

A interação que existe do líquido folicular com oócito serve para manter o mesmo e contribuir com o desenvolvimento oocitário. O objetivo deste estudo foi descrever o perfil de proteínas do líquido folicular ovariano de ovelhas em duas categorias de desenvolvimento dos folículos. Os ovários foram colhidos de um abatedouro e transportados até o laboratório. No laboratório, os ovários foram lavados com solução 0,9% NaCl, os folículos foram mensurados e classificados em duas categorias, folículos pequenos com diâmetro de < 4 mm e médios de ≥ 4 a 6 mm. O líquido folicular foi colhido por aspiração centrifugados a 800g por 10 minutos para retirada dos debris celulares e recentrifugados a 10.000g, durante 30 minutos a 4º C. A depleção de albumina foi conduzida e a concentração de proteínas totais foi mensurada pelo método de Bradford. Uma alíquota contendo 50 µg de proteína foi preparada para eletroforese unidimensional SDS-PAGE. A corrida foi interrompida quando as amostras atingiram o gel de separação e a digestão tríptica in gel foi realizada. Então, as amostras foram submetidas a espectrometria de massa com abordagem shotgun ESI-Q-TOF MS/MS. Os resultados foram submetidos à análise multivariada, por análise de componente principal (PCA), análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA) indicada pela pontuação VIP (projeção de importância variável – VIP score), dendrograma e ontologia gênica (função molecular, processo biológico e componente celular). Foi encontrado um total de 55 proteínas nos dois grupos, sendo 02 apenas no grupo < 4 mm e 13 no grupo 4 a 6 mm. A PCA identificou 2 grupos distintos, sendo a somatória de PC1 e PC2 > 50%. No VIP score foram encontradas 12 proteínas com α  1,5, sendo 2 mais abundantes no folículos com diâmetro < 4 mm e 10 nos folículos entre 4 a 6 mm. Concluindo-se que as proteínas descritas estão ligadas diretamente com o funcionamento do metabolismo folicular e desenvolvimento dos oócitos, participando do processo de ovulação e qualidade dos oócitos.

The interaction that exists between the follicular fluid and the oocyte serves to maintain it and contribute to oocyte development. The objective of this study was to describe the protein profile of the ovarian follicular fluid of sheep in two categories of follicle development. The ovaries were harvested from a slaughterhouse and transported to the laboratory. In the laboratory, the ovaries were washed with 0.9% NaCl solution, the follicles were measured and classified into two categories, small follicles with a diameter of < 4 mm and medium from ≥ 4 to -6 mm. The follicular fluid was collected by centrifuged aspiration at 800g for 10 minutes to remove the cellular debris and refocused at 10,000g for 30 minutes at 4ºC. Albumin depletion was conducted and the total protein concentration was measured by the Bradford method. An aliquot containing 50 µg of protein was prepared for SDS-PAGE unidimensional electrophoresis. The run was stopped when the samples reached the separation gel and tryptic digestion in gel was performed. Then, the samples were submitted to mass spectrometry with shotgun approach ESI-Q-TOF MS/MS. The results were submitted to multivariate analysis, by principal component analysis (PCA), discriminant analysis by partial least squares (PLS-DA) indicated by VIP score (projection of variable importance - VIP score), dendrogram and gene ontology (molecular function, biological process and cellular component). A total of 55 proteins were found in both groups, 02 only in the group < 4 mm and 13 in the group 4 to 6 mm. The PCA identified 2 distinct groups, being the sum of PC1 and PC2 > 50%. In the VIP score were found 12 proteins with α  1.5, being 2 more abundant in follicles with diameter < 4 mm and 10 in follicles between 4 and 6 mm. It was concluded that the proteins are directly linked to the functioning of the follicular metabolism and development of the oocytes, participating in the ovulation process and oocyte quality.