Bioprospecção de tanases produzidas por fungos endofíticos isolados de espécies vegetais da Caatinga

Abstract

O Bioma Caatinga, caracterizado por apresentar condições extremas de habitat, é fonte de novas espécies, como microrganismos endofíticos, com potencial para síntese de compostos bioativos. Esses microrganismos são responsáveis por produzir uma série de metabólitos de interesse biotecnológico como, por exemplo, enzimas. Entretanto, a tanase, enzima que hidrolisa ésteres e ligações laterais de taninos hidrolisáveis, produzindo glicose e ácido gálico ou ácido elágico, ainda é pouco explorada quanto à produção por microrganismos endofíticos. Essas enzimas são de grande interesse biotecnológico para aplicações em indústrias alimentícias, químicas, de bebidas e farmacêuticas. Diante disto, este estudo visou à prospecção de tanases produzidas por fungos endofíticos associados às plantas ricas em taninos encontradas no Bioma Caatinga. A partir das cascas das plantas angico (Anadenanthera colubrina Vell.), aroeira (Myracrodruon urundeuva Allemao), baraúna (Schinopsis brasiliensis Engl.), cajueiro (Anacardium occidentale L.) e catingueira (Caesalpinia pyramidalis Tul), coletadas no estado da Paraíba, foi possível isolar 16 fungos endofíticos para seleção dos produtores de tanase. Dentre os isolados, as espécies Aspergillus niger ANG18 e Aspergillus fumigatus CAS21 apresentaram maior produção de tanase. No processo de otimização em Fermentação Submersa (FSbm) A. niger ANG18 apresentou maior nível enzimático quando cultivado em meio Khanna, com 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm, enquanto que A. fumigatus CAS21 os maiores níveis foram atingidos quando cultivado em meio mineral, adicionado de peptona, 2% de ácido tânico, por 24 horas, a 37ºC e 120 rpm. Em Fermentação em Estado Sólido (FES), A. niger ANG18, cultivado em folhas de eucalipto, umidificado com sais de Khanna (1:1) por 96 horas a 37ºC, apresentou maior produção de tanase quando comparado a A. fumigatus CAS21. Contudo, A fumigatus CAS21 apresentou a maior produção da enzima de interesse em FSbm, a qual foi purificada 4,9 vezes com taxa de recuperação de 10,2%, e caracterizada bioquimicamente. A tanase de A. fumigatus CAS21 tem massa molecular nativa de 60,34 kDa, com 39,1% de conteúdo de carboidratos. Apresentou temperatura ótima de atividade no intervalo de 30 a 40ºC e tempo de meia vida (t50) de 120 minutos e 90 minutos a 30ºC e 45ºC, respectivamente. O valor de pH ótimo aparente de atividade foi 5,0, mantendo-se ativa quando incubada no pH 5,0-6,0 por 24 horas. A atividade enzimática foi aumentada na presença ureia, e inibida na presença de íons de ferro e concentrações de ácido gálico acima de 5mM. Os parâmetros cinéticos foram analisados e a enzima mostrou maior afinidade pelo substrato propil galato (Km = 3,61 mM) quando comparado ao ácido tânico (Km = 6,38 mM) e ao metil galato (Km = 6,28 mM). Contudo, a maior eficiência catalítica foi obtida para o substrato ácido tânico. A aplicação do extrato bruto para tratamento de efluentes de curtume do couro de bode reduziu em 89% o teor de taninos presentes após 2 horas de incubação. Deste modo, o fungo endofítico A. fumigatus CAS21 isolado de planta da Caatinga mostrou-se como um interessante produtor de tanase com propriedades importantes para aplicação industrial.

Caatinga Biome is characterized by extreme habitat conditions and presents source of new species like endophytic microorganisms with potential bioactive compounds synthesis. These microorganisms are responsible to produce metabolites with biotechnological interest, such as enzymes. However, tannase, an enzyme that promote esters and side bonds of hydrolyzes hydrolyzable tannins, producing glucose and gallic acid or ellagic acid, is still little explored in terms of its production by endophytic microorganisms. These enzymes have great biotechnological importance for applications in food, chemical, beverage and pharmaceutical industries. In view of this, this study aims to prospect the production of tannases by endophytic fungi associated with tannins rich plants from the Caatinga Biome. Barks of angico, aroeira, barauna, cashew and catingueira plants were collected in the State of Paraíba and 16 endophytic fungi strains were isolated for the selection of tannase producers. The species Aspergillus niger ANG18 and Aspergillus fumigatus CAS21 showed higher tannase production among the isolated microorganisms. In the process of optimization in Submerged Fermentation (SbmF) A. niger ANG18 presented a higher enzymatic level when grown in Khanna medium, with 2% tannic acid, for 24 hours at 37ºC and 120 rpm, while A. fumigatus CAS21 presented better levels when grown in mineral medium, with addition of peptone, 2% of tannic acid, for 24 hours, at 37ºC and 120 rpm. Under solid state fermentation (SSF), A. niger ANG18 cultivated in eucalypt leaves, humidified with Khanna salts (1:1) for 96 hours at 37ºC, presented higher tannase level when compared to A. fumigatus CAS21. However, A. fumigatus CAS21 showed the highest production of tannase under FSbm, which was purified 4.9 fold with recovery of 10.2%, and biochemically characterized. The A. fumigatus CAS21 tannase has a native molecular mass of 60.34 kDa, with 39.1% carbohydrate content. It presents optimum temperature of activity in the range from 30 to 40ºC and half-fife (t50) of 120 minutes and 90 minutes at 30ºC and 45ºC, respectively. The optimum apparent pH of activity was 5.0 and its activity was maintained when incubated at pH 5.0-6.0 for 24 hours. The tannase activity was improved in the presence of urea, and inhibited in the presence of iron ions and gallic acid above 5 mM. The kinetic parameters were analyzed and the enzyme showed higher affinity for the propyl gallate substrate (Km = 3.61 mM) compared to tannic acid (Km = 6.38 mM) and methyl gallate (Km = 6.28 mM). On the other hand, the best catalytic efficiency was obtained for the substrate tannic acid. The application of the crude filtrate to treat tannery effluents from goat leather reduced the tannin content 89% after 2 hours of incubation. Thus, the endophytic fungi A. fumigatus CAS21 isolated from Caatinga plant was an interesting producer of tannase with important properties for industrial application.