Capacitação espermática in vitro de sêmen equino congelado: Efeitos da composição dos diluentes sobre eventos funcionais associados à fertilização

Abstract

A fertilização in vitro em equinos ainda apresenta limitações relacionadas à dificuldade de reproduzir, em ambiente controlado, os eventos fisiológicos da capacitação espermática, especialmente quando se utiliza sêmen criopreservado. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a influência da composição lipídica dos diluentes de centrifugação e congelação sobre a viabilidade espermática, o efluxo de colesterol e a competência fecundante de espermatozoides equinos congelados. Para isso, foram conduzidos experimentos sequenciais avaliando parâmetros cinéticos, estruturais e funcionais. No Experimento I, avaliou-se a influência de diferentes diluentes de centrifugação (BotuSÊMEN®, BotuSÊMEN Special®, BotuSÊMEN KZ® e BotuSÊMEN Gold®) sobre os parâmetros cinemáticos espermáticos após incubação em meio capacitante. BotuSÊMEN KZ® e BotuSÊMEN Gold® apresentaram desempenho semelhante ao BotuSÊMEN®, com motilidade total de 51,37% e 53,26% e maiores valores de VCL (208,7 e 208,5 µm/s). No Experimento II, avaliou-se o efeito de diferentes diluentes de congelação (BotuCRIO®, G2, G3, G4 e G5) e do tempo de estabilização (20 min vs. 2 h) sobre a qualidade espermática pós-descongelação. BotuCRIO® e G4 apresentaram maior motilidade total (55,1% e 44,4%), enquanto G2 apresentou valores intermediários (42,7%), sem efeito do tempo de estabilização (P > 0,05). No Experimento III, investigou-se a combinação entre diluentes de centrifugação (BG e KZ) e de congelação (BC, G2, G2.1, G4 e G4.1), bem como o efeito da adição de leite desnatado. A combinação BG + BC apresentou os maiores valores de motilidade total (53,42%) e progressiva (26,00%), enquanto o leite reduziu esses parâmetros para 29,58–32,76%. No Experimento V, avaliou-se a dinâmica do efluxo de colesterol por citometria de fluxo. O efluxo ocorreu predominantemente nas primeiras horas, com redução da viabilidade de 75,3% para 53,3% em 9 horas (P < 0,001), sem influência dos diluentes (P > 0,05). No Experimento VI, avaliou-se a capacidade fecundante por fertilização in vitro, com taxas de clivagem de 17,4% (8/46) e blastocistos de 10,9% (5/46), com conversão de 62,5%. Conclui-se que a composição lipídica dos diluentes influencia a funcionalidade espermática e a competência fecundante, sendo a combinação entre BotuSÊMEN Gold® e G2 associada ao melhor equilíbrio entre estabilidade estrutural e responsividade funcional.

In vitro fertilization (IVF) in horses still presents limitations related to the difficulty of reproducing, under controlled conditions, the physiological events of sperm capacitation, especially when cryopreserved semen is used. In this context, the present study aimed to evaluate the influence of the lipid composition of centrifugation and freezing extenders on sperm viability, cholesterol efflux, and the fertilizing competence of frozen equine spermatozoa. To this end, sequential experiments were conducted evaluating kinematic, structural, and functional parameters. In Experiment I, the influence of different pre-centrifugation extenders (BotuSÊMEN®, BotuSÊMEN Special®, BotuSÊMEN KZ®, and BotuSÊMEN Gold®) on sperm kinematic parameters after incubation in capacitating medium was evaluated. BotuSÊMEN KZ® and BotuSÊMEN Gold® showed performance similar to BotuSÊMEN®, with total motility of 51.37% and 53.26% and higher VCL values (208.7 and 208.5 µm/s). In Experiment II, the effect of different freezing extenders (BotuCRIO®, G2, G3, G4, and G5) and stabilization time (20 min vs. 2h) on post-thaw sperm quality was evaluated. BotuCRIO® and G4 showed higher total motility (55.1% and 44.4%), whereas G2 showed intermediate values (42.7%), with no effect of stabilization time (P > 0.05). In Experiment III, the combination of pre-centrifugation extenders (BG and KZ) and freezing extenders (BC, G2, G2.1, G4, and G4.1), as well as the effect of skim milk addition, were investigated. The BG + BC combination showed the highest total (53.42%) and progressive motility (26.00%), whereas skim milk reduced these parameters to 29.58–32.76%. In Experiment V, cholesterol efflux dynamics were evaluated by flow cytometry. Efflux occurred predominantly in the early incubation period, with a decrease in sperm viability from 75.3% to 53.3% over 9 hours (P < 0.001), with no effect of extender composition (P > 0.05). In Experiment VI, fertilizing competence was assessed by in vitro fertilization, yielding cleavage rates of 17.4% (8/46) and blastocyst formation of 10.9% (5/46), with a conversion rate of 62.5%. It is concluded that the lipid composition of extenders influences sperm functionality and fertilizing competence, with the combination of BotuSÊMEN Gold® and G2 providing the best balance between structural stability and functional responsiveness.