Alterações metabólicas em células dendríticas durante a eferocitose de células apoptóticas de glioblastoma

Abstract

Estudos evidenciam que a morte celular imunogênica (ICD) desempenha um papel crucial no desenvolvimento de tratamentos antitumorais. No entanto, alguns agentes induzem a morte celular não imunogênica (NICD), como quimioterápicos e radioterápicos, resultando no acúmulo de células apoptóticas (ACs) no microambiente tumoral (TME). A eliminação de células mortas, denominada eferocitose, suprime a geração de respostas imunogênicas mediada por células dendríticas (DCs) e macrófagos no TME. Na última década, contribuições na área do imunometabolismo demonstram que diferentes vias metabólicas são ativadas durante a eferocitose que sustentam um fenótipo de macrófagos com função de reparo tecidual. Nesse contexto, a reprogramação metabólica de células imunes tem sido proposta como uma nova abordagem terapêutica para potencializar a imunidade antitumoral. Portanto, a hipótese deste estudo é que a eferocitose de células de glioblastoma apoptóticas (GBM-ACs) resulta na ativação de vias metabólicas que interferem diretamente no fenótipo tolerogênico de DCs, prejudicando a atividade funcional dessas células na ativação de linfócitos T. No entanto, a inibição dessas vias metabólicas favoreceria a reprogramação dessas células em perfil imunogênico. Os resultados obtidos demonstram que a eferocitose de GBM-ACs induz aumento na expressão de CD86 e PD-L1 e redução de CCR7 em BMDCs, associada ao aumento na produção de IL-6, IL-10 e TGF-β. A inibição da eferocitose por citocalasina-D reduziu a internalização de GBM-ACs e atenuou parcialmente o perfil adquirido, indicando que a internalização da AC é determinante para as respostas observadas. A análise da expressão gênica revelou que BMDCs regulam positivamente genes relacionados à via glicolítica, como Scl2a1, Hk2, Pkm2 e Ldha, após 3h, 6h e 18h de eferocitose, acompanhados de aumento do lactato extracelular. A inibição da glicólise por 2-DG reduziu CD86 e PD-L1 e restaurou CCR7, enquanto a via das pentoses-fosfato (PPP) e a síntese de ácidos graxos (FAS) também se mostraram necessárias para produção de IL-6 e IL-10, indicando que a integração entre glicólise, PPP e FAS sustenta o perfil pró-tumoral de BMDCs. Em contraste, a inibição da entrada de piruvato na mitocôndria (UK5099), a glutaminólise (CB839) e a β-oxidação (etomoxir) não alteraram o fenótipo de BMDCs, sugerindo que essas vias não contribuem para o suprimento de carbono ao ciclo de Krebs. O meio condicionado gerado por BMDCs que internalizaram GBM-ACs induziu a diferenciação de linfócitos Th17 e aumentou a produção de IL-17A e IFN-γ. Ensaios com linfócitos de camundongos OT-II confirmaram esse padrão, indicando que BMDCs no contexto da eferocitose mantêm capacidade de modular respostas T antígeno-dependentes. Em conjunto, nossos resultados demonstram que a eferocitose de GBM-ACs direciona BMDCs a um estado pró-tumoral sustentado por circuitos metabólicos específicos, influenciando a funcionalidade de linfócitos T. Além disso, esse estudo contribui para o entendimento de possíveis moduladores de vias metabólicas como possíveis alvos terapêuticos que visam modular células imunes disfuncionais em diversas patologias, especialmente aquelas sem opções terapêuticas disponíveis.

Studies have shown that immunogenic cell death (ICD) plays a crucial role in the development of antitumor therapies. However, some agents, such as chemotherapeutics and radiotherapy, induce non-immunogenic cell death (NICD), resulting in the accumulation of apoptotic cells (ACs) within the tumor microenvironment (TME). The clearance of dead cells, known as efferocytosis, suppresses the generation of immunogenic responses mediated by dendritic cells (DCs) and macrophages in the TME. Over the past decade, advances in the field of immunometabolism have demonstrated that distinct metabolic pathways are activated during efferocytosis, sustaining a tissue-repair phenotype in macrophages. In this context, metabolic reprogramming of immune cells has been proposed as a novel therapeutic strategy to enhance antitumor immunity. Therefore, this study hypothesizes that the efferocytosis of apoptotic glioblastoma cells (GBM-ACs) activates metabolic pathways that directly interfere with the tolerogenic phenotype of DCs, thereby impairing their functional activity in T-cell activation. Conversely, inhibition of these metabolic pathways would favor the reprogramming of these cells toward an immunogenic profile. Our results demonstrate that the efferocytosis of GBMACs induces increased expression of CD86 and PD-L1 and reduced expression of CCR7 in BMDCs, accompanied by enhanced production of IL-6, IL-10, and TGF-β. Inhibition of efferocytosis with cytochalasin D reduced GBM-AC internalization and partially attenuated the acquired profile, indicating that AC internalization is a determining factor for the observed responses. Gene expression analysis revealed that BMDCs upregulate glycolysis-related genes such as Slc2a1, Hk2, Pkm2, and Ldha after 3 h, 6 h, and 18 h of efferocytosis, accompanied by increased extracellular lactate levels. Inhibition of glycolysis with 2-DG reduced CD86 and PDL1 expression and restored CCR7, while the pentose phosphate pathway (PPP) and fatty acid synthesis (FAS) were also required for IL-6 and IL-10 production, indicating that the integration between glycolysis, PPP, and FAS sustains the pro-tumor profile of BMDCs. In contrast, inhibition of pyruvate entry into mitochondria (UK5099), glutaminolysis (CB839), and βoxidation (etomoxir) did not alter the BMDC phenotype, suggesting that these pathways do not contribute carbon to fuel the tricarboxylic acid cycle. The conditioned medium generated by BMDCs that had internalized GBM-ACs induced Th17 differentiation and increased IL-17A and IFN-γ production. Experiments using OT-II mouse T cells confirmed this pattern, indicating that BMDCs in the context of efferocytosis retain the capacity to modulate antigen-dependent T-cell responses. Taken together, our results demonstrate that the efferocytosis of GBM-ACs drives BMDCs toward a pro-tumor state sustained by specific metabolic circuits, thereby affecting Tcell functionality. In addition, this study contributes to the understanding of metabolic pathway modulators as potential therapeutic targets to modulate dysfunctional immune cells in different pathologies, especially in diseases for which effective therapeutic options are still lacking.