Proteoma do carcinoma mamário felino fixado em formalina e conservado em parafina

Abstract

O proteoma do carcinoma mamário felino fixado em formalina e incluído em parafina (FFCP) é uma opção para estudo dos tumores, haja vista a quantidade e variedade de amostras disponíveis, possibilitando investigações complexas, descoberta de biomarcadores e compreensão dos mecanismos fisiopatológicos dos tumores. O carcinoma mamário felino é considerado modelo experimental para o câncer de mama humano devido ao seu comportamento biológico e características histopatológicas semelhantes, o que pode facilitar a identificação de potenciais alvos terapêuticos e indicadores prognósticos. Ademais, este tipo de tumor nas gatas é caracterizado por sua natureza agressiva e baixa taxa de sobrevivência, apresentando 2 vezes mais tendência e 5 vezes mais probabilidade de desenvolver formas malignas quando comparado aos cães. Com base nisso, este estudo pretende caracterizar o proteoma de carcinoma mamário felino de 2 tipos, cribiforme (mais agressivo) e tubulopapilar (menos agressivo), de amostras FFPE obtidas de um banco histológico, a fim de identificar potenciais biomarcadores associados à progressão tumoral e do prognóstico. Para tanto, 21 amostras de carcinoma mamário felino FFPE foram obtidas de um banco de dados histológico e distribuídas em 2 grupos (cribiforme, n = 12 e tubulopapilar, n = 9). Após desparafinação e reidratação, as amostras foram digeridas com tripsina e a proteômica foi analisada por nLC-MS/MS por abordagem shotgun. Os dados foram submetidos à análise multivariada (análise de componentes principais), teste t, fold change e volcano plot (FDR < 0,05). Foram identificadas 976 proteínas, sendo que 148 proteínas tiveram abundância diferencial entre os grupos. A PCA revelou uma sobreposição entre os dois grupos em ambos os tipos de amostra, conforme evidenciado pelo mapa de calor. Das quinze principais proteínas analisadas que estavam presentes em ambos os tumores, 14 delas apresentaram maior expressão no tumor cribriforme em comparação ao tumor tubulopapilar, enquanto apenas 1 apresentou maior expressão no tumor tubulopapilar. De todas as proteínas extraídas das amostras, 4 proteínas eram exclusivas de FMC cribriforme e tubulopapilar, a saber, uma proteína não caracterizada (A0A337S6M6), nucleoproteína AHNAK (A0A337S8X8), glicerol quinase (A0A337SAZ0), miosina-2 (A0A337SF79); e glicosilceramidase beta 3 (A0A2I2UCJ0), beta-2-glicoproteína 1 (M3WH75), proteína contendo domínio SEA (M3WNR4) e proteína contendo domínio EF-hand (A0A337SCP2), respectivamente. Duas proteínas, a subunidade alfa da proteína 1 do complexo T (M3VZ89) e o Reticulon-3 (A0A5F5XKU7), indicando prognóstico desfavorável semelhante ao do câncer de mama humano, foram identificadas em ambos os grupos. As proteínas identificadas estavam relacionadas à esteroidogênese ovariana, processamento e apresentação de antígenos, processamento de proteínas, glicólise/gliconeogênese, sinalização de cálcio, geração e metabolismo de energia, reorganização citoesquelética, regulação do ciclo celular, dobramento de proteínas e resposta imune, refletindo alterações específicas do tumor na homeostase proteica e na maquinaria celular. Esses achados demonstram as diferenças nos mecanismos moleculares que impulsionam o FMC cribiforme e tubulopapilar, as vias metabólicas envolvidas e as proteínas específicas aumentadas, talvez causando os efeitos específicos e possíveis diferenças entre essas duas formas de tumores. Além disso, a identificação de duas proteínas específicas indicativas de mau prognóstico demonstra a similaridade, em nível molecular, entre esses dois tumores e o câncer de mama humano.

The proteome of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFCP) feline mammary carcinoma is an option for studying tumors, given the quantity and variety of samples available, enabling complex investigations, discovery of biomarkers, and understanding of the pathophysiological mechanisms of tumors. Feline mammary carcinoma is considered an experimental model for human breast cancer due to its similar biological behavior and histopathological characteristics, which can facilitate the identification of potential therapeutic targets and prognostic indicators. Furthermore, this type of tumor in cats is characterized by its aggressive nature and low survival rate, presenting a 2-fold greater tendency and 5-fold greater probability of developing malignant forms when compared to dogs. Based on this, this study aims to characterize the proteome of two types of feline mammary carcinoma, cribriform (more aggressive) and tubulopapillary (less aggressive), from FFPE samples obtained from a histological bank, in order to identify potential biomarkers associated with tumor progression and prognosis. For this purpose, 21 FFPE feline mammary carcinoma samples were obtained from a histological database and distributed into 2 groups (cribriform, n = 12 and tubulopapillary, n = 9). After deparaffinization and rehydration, the samples were digested with trypsin and proteomics were analyzed by nLC-MS/MS using a shotgun approach. The data were subjected to multivariate analysis (principal component analysis), t-test, fold change and volcano plot (FDR < 0.05). A total of 976 proteins were identified, with 148 proteins showing differential abundance between the groups. PCA revealed an overlap between the two groups in both sample types, as evidenced by the heat map. Of the fifteen main proteins analyzed that were present in both tumors, 14 of them showed higher expression in the cribriform tumor compared to the tubulopapillary tumor, while only 1 showed higher expression in the tubulopapillary tumor. Of all proteins extracted from the samples, 4 proteins each were unique to cribriform and tubulopapillary FMC, namely, an uncharacterized protein (A0A337S6M6), AHNAK nucleoprotein (A0A337S8X8), glycerol kinase (A0A337SAZ0), myosin-2 (A0A337SF79); and glucosylceramidase beta 3 (A0A2I2UCJ0), Beta-2-glycoprotein 1 (M3WH75), SEA domain-containing protein (M3WNR4), and EF-hand domain-containing protein (A0A337SCP2) respectively. 2 proteins, T-complex protein 1 subunit alpha (M3VZ89) and Reticulon-3 (A0A5F5XKU7)indicating poor prognosis similar to human breast cancer, being identified in both groups. The proteins identified were related to ovarian steroidogenesis, antigen processing and presentation, protein processing, glycolysis/gluconeogenesis, calcium signalling, energy generation and metabolism, cytoskeletal reorganization, cell cycle regulation, protein folding and immune response reflecting tumor-specific alterations in protein homeostasis and cellular machinery. These findings demonstrate the differences in the molecular mechanisms driving cribriform and tubulopapillary FMC, the metabolic pathways involved, and the specific proteins abundance, perhaps causing the specific effects and possible differences between these two forms of tumors. Furthermore, the identification of two specific proteins indicative of poor prognosis demonstrates the similarity, at the molecular level, between these two tumors and human breast cancer.