Comparação de métodos de extração abrangentes para estudos metabolômicos em tecidos vegetais empregando folhas de cana-de-açúcar como modelo

Abstract

As abordagens ômicas atualmente em destaque, e em desenvolvimento, tem por objetivo final o entendimento global do funcionamento de organismos a partir de uma perspectiva molecular abrangente. O preparo de amostra pode durar dias ou até semanas recorrendo a diversos tipos de técnicas, equipamentos e solventes. Claramente esse procedimento multietapas é fonte significativa de erros, gasto de solventes e tempo e por tempos acreditava-se que a elaboração de extrato era uma etapa crucial para estudos metabolômicos. Durante este processo evita-se alterar os metabólitos de um organismo, mantendo condições brandas da colheita até a análise em cromatografia líquida. Será que artefatos são gerados? Podemos confiar que os metabólitos não se decomponham até o fim das etapas de preparo? A resposta para estes questionamentos deriva de estudos a cerca de uma extração seguida dos processos de separação e detecção: extração em linha (do inglês, on-line extraction). Padronizando uma câmara de amostragem barata e de fácil acoplagem a um sistema de cromatografia, permitiu-nos evitar etapas longas de preparo de amostra. Neste método, substâncias discretas passaram a serem identificadas com elevado nível de precisão e reprodutibilidade. Este método, denominado OLE-UHPLC, permite fazer estudos a partir de 1 mg tecido fresco, onde o gradiente utilizado para a separação cromatográfica torna-se a mistura extratora da amostra. Parece uma solução próspera para análises de organismos pequenos ou até mesmo de fragmento tecidual com uma intensidade cromatográfica elevada, quando comparada aos métodos off-line. Por isso, comparou-se procedimentos de preparação de amostras para fingerprinting metabólico em tecidos vegetais com folhas de cana-de-açúcar como modelo, considerando a abrangência, a eficiência, a reprodutibilidade, a rapidez e a robustez.

The omic approaches currently highlighted, and under development, have as their ultimate goal the global understanding of the functioning of organisms from a comprehensive molecular perspective. Sample preparation can take days or even weeks using different types of techniques, equipment and solvents. Clearly, this multi-step procedure is a significant source of errors, waste of solvents and time, and for some time it was believed that extract elaboration was a crucial step for metabolomic studies. During this process, the alteration of an organism's metabolites is avoided, maintaining mild conditions from harvest to analysis in liquid chromatography. Are artifacts generated? Can we trust the metabolites not to decompose until the end of the preparation steps? The answer to these questions derives from studies about one extraction followed by separation and detection processes: online extraction. Standardizing an inexpensive sampling chamber that is easy to attach to a chromatography system allowed us to avoid long sample preparation steps. In this method, discrete substances started to be identified with a high level of precision and reproducibility. This method, called OLE-UHPLC, allows studies to be carried out from 1 mg of fresh tissue, where the gradient used for chromatographic separation becomes the sample extracting mixture. It seems to be a successful solution for analyzing small organisms or even tissue fragments with a high chromatographic intensity, when compared to off-line methods. Therefore, we compared sample preparation procedures for metabolic fingerprinting in plant tissues with sugarcane leaves as a model, considering the range, efficiency, reproducibility, speed and robustness.