Caracterização de bacteriófagos como alternativa para o tratamento convencional de infecções causadas por Klebsiella multirresistentes

Os bacteriófagos (fagos) são antagonistas naturais de bactérias, o que os torna candidatos interessantes para terapias alternativas contra infecções. Além da partícula viral, as enzimas que eles geram representam alvos biotecnológicos promissores. O aumento de cepas bacterianas multirresistentes (MDR) intensificou a necessidade de novas técnicas de controle. Com isso, este estudo examinou as espécies de Klebsiella spp. e isolados de bacteriófagos depositados na coleção do laboratório para investigar suas propriedades em aplicações terapêuticas. Além disso, as enzimas virais endolisinas e despolimerases desses isolados foram investigadas com o objetivo de identificar, isolar, expressar e purificar buscando alvos com ação contra biofilme e peptidoglicano. Capítulo 1: este projeto buscou caracterizar bacteriófagos de Klebsiella spp., uma espécie bacteriana de considerável preocupação global, para explorar seu potencial como alternativa terapêutica no combate a infecções. Análises de dados genômicos foram realizadas em isolados de fagos e cepas de Klebsiella, em conjunto com a caracterização biológica dos fagos sob diversas condições. Os resultados revelaram que os isolados de fagos são distintos entre si, identificando os gêneros Webervirus, Drulisvirus, Koutsourovirus e Taipeivirus, além de um novo gênero. Os fagos demonstraram estabilidade em diversas temperaturas (−80 °C, −20 °C, 4 °C, 20 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) e em uma faixa de pH de 7,5 a 11,0. O espectro de infecção das cepas de Klebsiella examinadas apresentou um espectro limitado de hospedeiros. As linhagens reconhecidas de Klebsiella compreendem as subespécies Klebsiella pneumoniae e Klebsiella quasipneumoniae. Algumas das linhagens identificadas foram designadas como ST258 (KH1, KH55 e KH92). Genes associados à resistência a carbapenemases foram identificados em clones ST258, apesar de sua baixa pontuação de virulência. Os resultados destacam a importância da identificação de fagos que possam atingir eficazmente cepas multirresistentes e que sejam adequados para uso terapêutico. Capítulo 2: as enzimas de fagos são notáveis por sua capacidade de superar a resistência microbiana. O objetivo deste estudo foi examinar endolisinas e depolimerases derivadas de bacteriófagos de Klebsiella como um potencial tratamento para infecções causadas por Klebsiella pneumoniae. Endolisinas são enzimas que destroem o peptidoglicano bacteriano internamente, enquanto depolimerases degradam biofilmes, podendo ter como alvo o EPS, CPS e LPS da bactéria. Seis endolisinas virais foram identificadas, produzidas e avaliadas contra extratos de bactérias Gram-negativas em ágar e pelo ensaio de redução da turbidez de esferoplastos de P. aeruginosa. Apenas uma única enzima, isolada do fago KP62, demonstrou atividade enzimática. A atividade das depolimerases foi avaliada em uma camada de células hospedeiras de Klebsiella, não revelandohalo de degradação, o que indica que as enzimas purificadas não possuem atividade. A estrutura da endolisina KP26 revelou uma proporção significativa de α-hélices. Este estudo ilustra os desafios na obtenção de uma endolisina ou despolimerase funcionais, o que torna necessária a expansão da pesquisa nesta área para abordar as lacunas existentes e investigar as enzimas virais.

Resumo (inglês)

Bacteriophages (phages) are natural antagonists of bacteria, making them interesting candidates for alternative therapies against infections. In addition to the viral particle, the enzymes they generate represent promising biotechnological targets. The increase in multidrug-resistant (MDR) bacterial strains has intensified the need for new control techniques. Therefore, this study examined Klebsiella spp. species and bacteriophage isolates deposited in the laboratory collection to investigate their properties in therapeutic applications. Furthermore, the viral enzymes of these isolates were investigated with the aim of identifying, isolating, expressing, and purifying them, seeking targets with action against biofilm and peptidoglycan. Chapter 1: This project sought to characterize bacteriophages of Klebsiella spp., a bacterial species of considerable global concern, to explore their potential as a therapeutic alternative in combating infections. Genomic data analyses were performed on phage isolates and Klebsiella strains, along with biological characterization of the phages under various conditions. The results revealed that the phage isolates are distinct from each other, identifying the genera Webervirus, Drulisvirus, Koutsourovirus, and Taipeivirus, in addition to a new genus. The phages demonstrated stability at various temperatures (−80 °C, −20 °C, 4 °C, 20 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C) and in a pH range of 7.5 to 11.0. The infection spectrum of the examined Klebsiella strains showed a limited host range. The recognized Klebsiella lineages comprise the subspecies Klebsiella pneumoniae and Klebsiella quasipneumoniae. Some of the identified lineages were designated as ST258 (KH1, KH55, and KH92). Genes associated with carbapenemase resistance were identified in ST258 clones, despite their low virulence score. The results highlight the importance of identifying phages that can effectively target multidrug-resistant strains and are suitable for therapeutic use. Chapter 2: Phage enzymes are notable for their ability to overcome microbial resistance. The aim of this study was to examine endolysins and depolymerases derived from Klebsiella bacteriophages as a potential treatment for infections caused by Klebsiella pneumoniae. Endolysins are enzymes that destroy bacterial peptidoglycan internally, while depolymerases degrade biofilms, potentially targeting EPS, CPS, and LPS of the bacteria. Six viral endolysins were identified, produced, and evaluated against extracts of Gram-negative bacteria on agar and Pseudomonas aeruginosa spheroplasts. Only one enzyme, isolated from phage KP62, demonstrated enzymatic activity. The activity of the depolymerases was evaluated in a layer of Klebsiella host cells, revealing no degradation halo, indicating that the purified enzymes are not active. The structure of endolysin KP26 revealed a significant proportion of α-helices. This study illustrates the challenges in obtaining a functional endolysinor depolymerase, making it necessary to expand research in this area to address existing gaps and investigate viral enzymes.

Palavras-chave

Endolisina , Despolimerase , Fago , Bioinformática , MDR

Idioma

Português

Citação

HYPOLITO, Giovane Böerner. Caracterização de bacteriófagos como alternativa para o tratamento convencional de infecções causadas por Klebsiella multirresistentes. 2026. Tese (Doutorado em Biologia Celular, Molecular e Microbiologia) – Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio Claro, 2026.