Zebrafish in vitro: cultura celular de ZFL para avaliar a hepatotoxicidade induzida pelos contaminantes de preocupação emergente triclopir e decametilciclopentasiloxano (D5)

Abstract

O rápido crescimento populacional, aliado ao desenvolvimento industrial e tecnológico acelerado, tem impulsionado uma produção em larga escala de muitos compostos químicos. Esses compostos englobam uma ampla gama de aplicações, como moléculas sintéticas em produtos de cuidados pessoais (PCPs) e praguicidas, por exemplo. Embora esses produtos tragam benefícios para a sociedade, podem ser liberados durante seu ciclo de vida e possivelmente causar efeitos adversos à saúde única, sendo categorizados como Contaminantes de Preocupação Emergente (CPEs). Dentro dessa classe, podemos destacar o triclopir, um herbicida que atua controlando plantas daninhas perenes de folhas largas e lenhosas; e o decametilciclopentasiloxano (D5), um silicone presente em produtos de cuidados pessoais (PCPs). Para elucidar e ajudar a construir estruturas conceituais de toxicidade para esses CPEs, os testes toxicológicos são fundamentais. E entre as Novas Abordagens Metodológicas (NAMs) aplicadas à toxicologia estão as culturas de células em monocamada (2D), com destaque a linhagem hepática de Zebrafish (ZFL), que se trata de um organismo modelo que possui 71% de similaridade e conservação do metabolismo de xenobióticos e do material genético em comparação com os seres humanos, o que o torna um excelente modelo para a toxicologia e integra o conceito de saúde única. Em vista disso, foram realizados ensaios para avaliar os efeitos tóxicos do triclopir e do D5 em hepatócitos de Zebrafish nas concentrações de 0,5; 5; 50; 100 e 500 µmol/L, por meio de citotoxicidade (ensaios de viabilidade, proliferação, ciclo celular e morte celular por apoptose) e da atividade mitocondrial (potencial de membrana mitocondrial, concentração celular de ATP) e produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio - ERON. Para o D5, foram observados resultados significativos nos ensaios de proliferação celular, em 24 horas (100 µmol/L) e em 48h (100 e 500 µmol/L) e ciclo celular em 24 horas, na fase S (0,5; 5 e 500 µmol/L) e na fase G2/M (todas as concentrações avaliadas). O triclopir causou alterações significativas na capacidade metabólica (500 µmol/L) e no potencial de membrana mitocondrial (todas as concentrações testadas) em células expostas por 48 h, bem como na proliferação celular e na produção de ERON em células expostas a 500 µmol/L por 24 h. Ambas as substâncias não apresentaram morte celular, evidenciado nos ensaios de anexina v/PI e anormalidades nucleares. Com esses resultados, é possível contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação do D5 e do triclopir, uma vez que o estudo demonstrou que essas substâncias interferem no funcionamento das células hepáticas de Zebrafish. Além disso, o estudo reforça a viabilidade da linhagem ZFL como um modelo experimental robusto para ensaios de toxicidade.

Rapid population growth, combined with rapid industrial and technological development, has driven the large-scale production of many chemical compounds. These compounds encompass a wide range of applications, such as synthetic molecules in personal care products (PCPs) and pesticides, for example. Although these products bring benefits to society, they can be released during their life cycle and potentially cause adverse effects on human health, being categorized as Contaminants of Emerging Concern (CECs). Within this class, we can highlight triclopyr, a herbicide that controls perennial broadleaf and woody weeds; and decamethylcyclopentasiloxane (D5), a silicone found in personal care products (PCPs). To elucidate and help build conceptual frameworks of toxicity for these ECCs, toxicological testing is essential. Among the New Methodological Approaches (NMAs) applied to toxicology are two-dimensional (2D) monolayer cell cultures, with particular emphasis on the zebrafish liver cell line (ZFL), which is a model organism that shares 71% similarity and conservation in xenobiotic metabolism and genetic material compared to humans, making it an excellent model for toxicology and aligning with the One Health concept. In view of this, assays were conducted to evaluate the toxic effects of triclopyr and D5 on zebrafish hepatocytes at concentrations of 0.5, 5, 50, 100, and 500 µmol/L, using cytotoxicity assays (viability, proliferation, cell cycle, and apoptotic cell death) and mitochondrial activity assays (mitochondrial membrane potential, cellular ATP concentration) as well as the production of reactive oxygen and nitrogen species (ROS/RNS). For D5, significant results were observed in cell proliferation assays at 24 hours (100 µmol/L) and 48 hours (100 and 500 µmol/L) and in the cell cycle at 24 hours, in the S phase (0.5; 5, and 500 µmol/L) and in the G2/M phase (all concentrations evaluated). Triclopyr caused significant alterations in metabolic capacity (500 µmol/L) and mitochondrial membrane potential (all concentrations tested) in cells exposed for 48 h, as well as in cell proliferation and ERON production in cells exposed to 500 µmol/L for 24 h. Neither substance caused cell death, as evidenced by annexin V/PI staining and nuclear abnormalities. These results contribute to our understanding of the mechanisms of action of D5 and triclopyr, as the study demonstrated that these substances interfere with the function of zebrafish liver cells. Furthermore, the study reinforces the viability of the ZFL line as a robust experimental model for toxicity assays.