Publicação: Caracterização de Estafilococos Coagulase-Negativa de origem hospitalar e comunitária quanto à diversidade clonal e a determinantes de resistência antimicrobiana
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Data
Autores
Orientador
Cunha, Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da 
Coorientador
Pós-graduação
Biologia Geral e Aplicada - IBB
Curso de graduação
Título da Revista
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Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
A alta frequência de Estafilococos Coagulase-Negativa (CoNS) na pele de indivíduos saudáveis e em doenças associadas ao sangue, associados à seleção de cepas resistentes devido a uso indiscriminado de antimicrobianos, tornou mais estreitos os limites entre o ambiente hospitalar e o comunitário quanto à distribuição de cepas. Objetivou-se, com este estudo, caracterizar isolados de CoNS de origem hospitalar e comunitária da cidade de Botucatu-SP quanto ao perfil clonal, analisar os aspectos de resistência à oxacilina pela aferição de metodologia de detecção, e investigar os determinantes de heterorresistência à vancomicina nessas cepas. As espécies estudadas incluíram S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis, S. capitis, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. simulans e S. xylosus. O teste de disco-difusão (TDD) com discos de oxacilina e cefoxitina, fitas de Etest impregnadas com oxacilina e pesquisa do gene mecA por PCR em tempo real foram realizadas. A triagem em ágar com 6 e 8 µg/ml de vancomicina, microdiluição em caldo para aferição da Concentração Inibirtória Mínima (MIC), microscopia eletrônica de transmissão para verificar espessamento da parede celular e alterações fenotípicas por testes bioquímicos foram realizadas. O perfil clonal foi determinado por PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) e para clones de S. epidermidis, o MLST (Multilocus Sequence Typing). S. epidermidis apresentou alta diversidade clonal, mas presença de clusters no ambiente hospitalar e na comunidade. Clones hospitalares pertenciam aos STs (sequence-types) 2, 6 e 23. S. haemolyticus revelou pequenos clones circulando separadamente nos ambientes, enquanto S. saprophyticus mostrou altíssima diversidade clonal. Clusters grandes circulando no hospital e comunidade foram encontrados em isolados de S. lugdunensis, S. warneri e S. capitis, demonstrando que provavelmente, nestas espécies, há baixa taxa de eventos de diversidade ou certos clones podem estar se sobressaindo em detrimento de outros. A variedade dos tipos de SCCmec foi bem elevada, sendo que isolados do mesmo cluster possuiam tipos distintos. S. epidermidis teve alta prevalência dos tipos I e III, S. haemolyticus dos tipos I e II, S. capitis do tipo V, S. hominis esteve associado ao complexo mec do tipo A e ccr1, S. warneri e S. saprophyticus ao SCCmec tipo I. A geração de elementos e combinações novas dos genes do cassete se mostrou altamente relacionada às cepas de CoNS, sugerindo que o SCCmec não é um bom marcador para clonalidade nessas bactérias. A concordância entre as técnicas da susceptibilidade à oxacilina foi observada em 65,7% dos casos; bem como, dos isolados resistentes pelo Etest, 93,8% possuíam o gene mecA. A maior discrepância entre mecA/Etest sensível foi em espécies não-epidermidis. Utilizando-se um ponto de corte de ≤19 mm no disco de oxacilina para resistência classificou-se melhor o total de CoNS. Para S. epidermidis separadamente, halos ≤ 19 e 27 mm, respectivamente, classificaram melhor nos discos de oxacilina e cefoxitina. Para S. haemolyticus e S. capitis, respectivamente, diâmetros ≤21 mm e ≤18 mm no disco de oxacilina, e MICs ≥ 0,75 µg/ml para S. warneri para resistência se adequaram melhor à avaliação de resistência à oxacilina nessas espécies. S. saprophyticus mostrou resultados altamente discrepantes, necessitando de uma revisão profunda nos valores de referência. Apesar de o disco de oxacilina não ser mais recomendado pelo CLSI para TDD, observamos alguns casos em que apenas este disco detectou resistência. A discrepância dos testes fenotípicos quando comparada à positividade do gene mecA foi provavelmente devida à característica heterogênea dessa resistência, e ao mecanismo de resistência borderline. De 291 isolados, 12,4% apresentaram crescimento nas placas com 6 ou 8 µg/ml de vancomicina: 8,3% de swab nasal e 19% de hemoculturas. Os MICs de vancomicina estiveram em valores maiores ou iguais a 4 µg/ml em 10 isolados parentais e em 22 colônias heterorresistentes. Colônias crescidas na triagem de isolados selecionados de S. warneri, S. haemolyticus e S. capitis mostraram espessamento de parede celular significativo quando comparado à cepa parental e diâmetro reduzido nos isolados heterorresistentes de S. haemolyticus e S. warneri. Observou-se que 60% das subpopulações apresentaram alteração macroscópica no aspecto das colônias, incluindo diferença de tamanho (27%), e a variação dentro do mesmo isolado (38%). A alteração na fermentação dos açúcares e ornitina foi encontrada, mas não seguiu um padrão. A presença de colônias mistas com características distintas demonstra a necessidade de testar todas quanto à susceptibilidade e identificação fenotípica. Os resultados enfatizam que a subpopulação heterorresistente necessita estar em um número suficiente de células para se expressar nos testes de susceptibilidade e possui natureza instável. O mecanismo de espessamento da parede celular parece ser a causa mais provável de heterorresistência em S. capitis, S. warneri e S. haemolyticus.
Resumo (inglês)
The high frequency of Coagulase-Negative Staphylococci (CoNS) on the skin of healthy individuals and in bloodstream infections, together with the selection of resistant strains, has narrowed the boundaries between the hospital and the community environment for the distribution of strains. This study aimed to characterize CoNS isolated from clinical and colonization specimens of patients and individuals from Botucatu-SP, to compare their clonal profile, to analyze the determination of oxacillin resistance by the evaluation of the methodology of detection, and to investigate the determinants of reduced susceptibility to vancomycin in those strains. CoNS species included S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S. lugdunensis, S. capitis, S. saprophyticus, S. pasteuri, S. simulans and S. xylosus. The disc diffusion test (DDT) using oxacillin and cefoxitin discs was employed, Etest strips impregnated with oxacillin and mecA gene detection by real-time PCR were used. An agar screening with 6 and 8 µg/ml of vancomycin, the broth microdiluition method for the Minimal Inhibitory Concentration (MIC), the transmission eletronic microscopy for evaluation of cellwall thickening and phenotypic modifications by biochemical tests were performed. Clonal profile was determined by PFGE (Pulsed-Field Gel Eletrophoresis) and, for S. epidermidis clones, MLST (Multilocus Sequence Typing). S. epidermidis presented high clonal diversity, despite some clusters circulating within hospital and community. Hospital clones belonged to STs (sequence-types) 2, 6 and 23. S. haemolyticus revealed small clones circulating separately in the environments, and S. saprophyticus showed high clonal diversity. Large clusters circulating in hospital and community were found for S. lugdunensis, S. warneri and S. capitis, demonstrating that those species probably have a low rate of diversity events or some clones may be standing out to the detriment of others. The variety of SCCmec types were high, and isolates from the same cluster held different types. S. epidermidis showed high prevalence of types I and III, S. haemolyticus of types I and II, S. capitis type V, S. hominis was associated to mec complex A and ccr1, S. warneri and S. saprophyticus to SCCmec type I. The generation of elements and novel combinations of cassette genes has shown to be highly related to CoNS strains, suggesting that SCCmec is not a good marker for clonality on those bacteria. Agreement between all techniques was observed in 65.7% of cases. Among isolates identified as resistant by the E-test, 93.8% carried mecA. The greatest discrepancy between mecA/susceptible E-test was observed for non-epidermidis species, particularly S. warneri. A resistance breakpoint ≤19 mm using the oxacillin disc was found to best classify all CoNS isolates. For S. epidermidis, diameters ≤19 mm and ≤27 mm provided the best classification using oxacillin and cefoxitin discs, respectively. For S. haemolyticus and S. capitis, oxacillin zone diameters ≤21 mm and ≤18 mm, respectively, and, for S. warneri, MICs for resistance ≥ 0.75 mg/L best represented susceptibility of the strains. Discrepant results between DDTs and between E-test and mecA were obtained for S. saprophyticus, a fact indicating the need for a critical revision of the reference values. Although the oxacillin DDT is no longer recommended by the CLSI, we observed some cases in which only this test detected resistance. The discrepancy between phenotypic tests and mecA gene detection is probably due to the heterogeneity of this resistance, with the phenomenon of borderline resistance being very common. Among 291 isolates, 12.4% grew on plates with 6 or 8 mg/L vancomycin; of these, 8.3% were isolated from nasal swabs and 19% from blood cultures. The vancomycin MIC was ≥4 mg/L in 10 parental isolates and in 22 heteroresistant colonies. Colonies recovered by screening from selected isolates of S. warneri, S. haemolyticus and S. capitis exhibited significant cell wall thickening when compared to the parental strain, and reduction in cell diameter in heteroresistant S. haemolyticus and S. warneri isolates. Macroscopic alterations in colony appearance were found in 60% of the subpopulations, including size variations (27%) which were also observed within the same isolate (38%). Sugar and ornithine fermentation was found to be altered but did not follow a pattern. The presence of mixed colonies with distinct characteristics highlights the need to test all colonies for susceptibility and phenotypic identification. The results demonstrate the unstable nature of the heteroresistant subpopulation and that the expression of this phenotype in susceptibility tests requires the presence of a sufficient number of cells. The mechanism of cell wall thickening appears to be the most likely cause of heteroresistance in S. capitis, S. warneri and S. haemolyticus.
Descrição
Palavras-chave
Oxacilina, teste de disco-difusão, cefoxitina, Etest, gene mecA, vancomicina, espessamento de parede celular, alterações morfo-bioquímicas, PFGE, SCCmec, MLST, Oxacillin, disc-diffusion test, cefoxitin, mecA gene, vancomycin, cellwall thickening, morpho-biochemical alterations
Idioma
Português
