Desenvolvimento de peptídeos derivados de toxinas de serpentes com ação inibitória contra o alvo molecular Tripanotiona Redutase: um estudo in silico e in vitro

Abstract

Este trabalho aborda o desenvolvimento de inibidores para a Tripanotiona-Redutase (TR), um alvo molecular relevante em tripanossomatídeos, que por sua vez causam grande parte das mortes associadas a doenças tropicais negligenciadas. Para alcançar esse objetivo, foram empregadas ferramentas computacionais que refletem o estado da arte, incluindo AlphaFold, S4PRED, AutoDockGPU, ClusPro e Gromacs 2022, visando modelar inibidores a partir de biomoléculas encontradas em venenos de serpentes do gênero Bothrops. Inicialmente a estrutura do alvo Tripanotiona-Redutase de Leishmania brasiliensis (LbTR) foi validada através de simulações de dinâmica molecular (DM) em uma escala de microsegundos. Em seguida, foi realizada uma triagem computacional de toxinas botrópicas disponíveis no Protein Data Bank contra a LbTR, gerando 22 complexos, dos quais 12 indicaram toxinas com interação obstruindo o sítio ativo da LbTR. Logo após, um virtual screening foi realizado com cerca de 16,2 mil peptídeos derivados de toxinas botrópicas, possibilitando a seleção de quatro peptídeos com alta afinidade pela LbTR, os quais foram submetidos a simulações de DM. Adicionalmente, esses quatro peptídeos foram submetidos a um virtual screening reverso contra 14 TRs de diferentes espécies de Leishmania e Trypanosoma. A expressão recombinante da LbTR foi realizada em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade, alcançando um rendimento de ~15 mg/L. Subsequentemente, a cinética enzimática da LbTR foi realizada utilizando o seu substrato natural, resultando na determinação do Km e Vmax de 18,8 µM e 23 µM/min, respectivamente. Posteriormente, foi realizada a caracterização biofísica da LbTR por espalhamento de luz dinâmico, dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. Levando em consideração o potencial dos resultados computacionais, o veneno de Bothrops jararacussu foi fracionado para o isolamento da miotoxina BthTX-I, que foi testada como inibidora da LbTR. A miotoxina exibiu um forte efeito inibitório sobre a atividade enzimática da LbTR, atingindo um IC50 de 1,9 µM. Os ensaios de interação molecular por cromatografia de bioafinidade confirmaram a ligação da BthTX-I à LbTR. Em ensaios de cinética enzimática, a BthTX-I exibiu um mecanismo de inibição do tipo misto sobre a LbTR, com um Ki de 1,88 µM e αKi de 10,69 µM. A avaliação experimental dos peptídeos selecionados in silico revelou que todos os quatro apresentam atividade inibitória em diferentes graus, sendo que o peptídeo KKFW alcançou a maior eficácia, com uma inibição de até 45% da LbTR. Em síntese, os resultados deste estudo evidenciam o potencial de toxinas de serpentes como uma fonte promissora para o desenvolvimento de inibidores eficazes para o alvo molecular estudado.

This work addresses the development of inhibitors for Trypanothione Reductase (TR), a molecular target in trypanosomatids, which are responsible for a considerable portion of the deaths associated with neglected tropical diseases. To achieve this goal, state-of-the-art computational tools were employed, including AlphaFold, S4PRED, AutoDockGPU, ClusPro, and Gromacs 2022, aiming to model inhibitors from biomolecules found in the venoms of snakes of the Bothrops genus. Initially, the structure of the Trypanothione Reductase from Leishmania brasiliensis (LbTR) was validated through molecular dynamics (MD) simulations on a microsecond scale. Next, a computational screening of botropic toxins available in the Protein Data Bank against LbTR was conducted, resulting in 22 complexes, of which 12 indicated toxins interacting and obstructing the active site of LbTR. Following this, a virtual screening was performed with approximately 16,200 peptides derived from botropic toxins, enabling the selection of four peptides with high affinity for LbTR, which were subjected to MD simulations. Additionally, these four peptides underwent reverse virtual screening against 14 TRs from different Leishmania and Trypanosoma species. The recombinant expression of LbTR was performed in E. coli and purified by affinity chromatography, achieving a yield of ~15 mg/L. Subsequently, the enzymatic kinetics of LbTR were carried out using its natural substrate, resulting in the determination of Km and Vmax values of 18.8 µM and 23 µM/min, respectively. Later, biophysical characterization of LbTR was performed using dynamic light scattering, circular dichroism, and fluorescence spectroscopy. Considering the potential of computational results, the venom of Bothrops jararacussu was fractionated for the isolation of myotoxin BthTX-I, which was tested as an inhibitor of LbTR. The myotoxin exhibited a strong inhibitory effect on the enzymatic activity of LbTR, achieving an IC50 of 1.9 µM. Molecular interaction assays by bioaffinity chromatography confirmed the binding of BthTX-I to LbTR. In enzymatic kinetics assays, BthTX-I exhibited a mixed-type inhibition mechanism on LbTR, with a Ki of 1.88 µM and αKi of 10.69 µM. Experimental evaluation of the peptides selected in silico revealed that all four showed inhibitory activity to varying degrees, with the peptide KKFW achieving the highest efficacy, inhibiting up to 45% of LbTR activity. In summary, the results of this study highlight the potential of snake toxins as a promising source for the development of effective inhibitors for the studied molecular target.