Avaliação de microRNA-140 em Vesículas extracelulares secretadas por células tronco mesenquimais derivadas de membrana sinovial equina

Abstract

A função parácrina das células-tronco (MSCs) é desempenhada também por vesículas extracelulares (VEs). Assim, as VEs têm impacto funcional nas célulasalvo e nos mecanismos de controle de enfermidades por meio da entrega de microRNAs. A exemplo, na osteoartrite, em que a homeostase articular é regulada pelo microRNA-140. O objetivo deste trabalho foi caracterizar vesículas extracelulares (VEs) liberadas por células-tronco mesenquimais derivadas de membrana sinovial (eqSMMSC) e avaliar a expressão de microRNA-140 nas VEs e nas eqSMMSC em dois modelos de cultivo celular, além de, comparar a secreção de VEs e a expressão do microRNA-140 em ambiente inflamatório in vitro. Quatro grupos experimentais foram definidos. Grupos controle, um cultivo de eqSMMSCs 2D e um cultivo de eqSMMSCs 3D. Grupos induzidos, também divididos em 2D-OA e 3D-OA, porém foram expostos ao meio de cultivo simulando o ambiente inflamatório da osteoartrite “OA-Like” (IL-1β e TNF-α). Amostras dos meios de cultivo de todos os grupos foram coletadas após 24, 72 e 120 horas de incubação para isolamento e caracterização de VEs. O isolamento de VEs foi realizado com kit comercial pelo método de precipitação. A caracterização foi realizada pela NTA, MET e expressão de mRNA das tetraspaninas CD9, CD63 e CD81. A análise da expressão do microRNA-140 em VEs e células por RT-qPCR e do mRNA da ADAMTS5 também por RT-qPCR. As VEs puderam ser isoladas e caracterizadas em todos os grupos e momentos experimentais. A expressão do microRNA-140 nas eqSMMSCs, o grupo 3D-OA teve maior expressão em relação aos demais grupos nos momentos 24 h e em 72 h à ambos os controles e ao 2D-OA; no momento 120 h, houve maior expressão do grupo 3D em relação aos tratados 2D-OA e 3D-OA. Já a expressão do microRNA-140 nas VEs, destaca-se no momento 72 h, onde o grupo 3D teve expressão significativa em relação aos demais, e no momento 120 h, a expressão também significativa foi do 2D-OA em relação aos demais. Na análise 7 da expressão do mRNA ADAMTS5, pode-se destacar o momento 120 h, onde o grupo 3D-OA obteve maior expressão em relação aos controles 2D e 3D. Os dados obtidos apontaram que o modelo e as técnicas utilizadas foram eficazes para o isolamento e caracterização das VEs e para a identificação da expressão de microRNA nos diferentes grupos e momentos. A expressão do microRNA-140 em resposta ao ambiente inflamatório é desempenhada por eqSMMSCs, sendo que, em células 3D demonstrou-se ser rápida e em VEs oriundas de células cultivadas em 2D tardia.

The paracrine function of stem cells (MSCs) is mainly performed by extracellular vesicles (EVs). Thus, the EV have functional impact on target cells and mechanisms of disease control through delivery microRNAs. For example, in osteoarthritis, in which joint homeostasis is regulated by microRNA-140. The objective of this work was to characterize extracellular vesicles (EVs) released by synovial membrane derived-mesenchymal stem cells (eqSMMSC) and to evaluate the expression of microRNA-140 in EVs and eqSMMSC cultivated in two cell culture models, in addition to comparing the secretion of EVs and the expression of microRNA-140 in an in vitro inflammatory environment. smMSCs were cultured and divided into four experimental groups. Control groups, one cultivation of 2D eqSMMSCs and one cultivation of 3D eqSMMSCs. Treated groups, also divided into 2D-OA and 3D-OA but were exposed to the culture medium simulating the “OA-Like” osteoarthritis inflammatory environment (IL-1β and TNF-α). Culture media samples from all groups were collected after 24, 72 and 120 hours of incubation for isolation and characterization of EVs. Isolation of EVs was performed with a commercial kit using the precipitation method. Characterization was performed by NTA, TEM and mRNA expression of tetraspanins CD9, CD63 and CD81. Analysis of microRNA-140 expression in EVs and cells by RT-qPCR and ADAMTS5 mRNA in EVs also by RT-qPCR. EVs could be isolated and characterized in all groups and time points. The expression of microRNA-140 in eqSMMSCs, the 3D-OA group had greater expression in relation to the other groups at time points 24 h; and in 72 h for both controls and 2D-OA; at 120 h, there was greater expression in the 3D group compared to those treated 2D-OA and 3D-OA. The expression of microRNA-140 in EVs stands out at 72 h, where the 3D group had significant expression in relation to the others, and at 120 h, the expression was also significant for 2D-OA in relation to the others. In ADAMTS5 analysis of mRNA expression, the 120 h time point can be 9 highlighted, where the 3D-OA group showed higher expression compared to control 2D and 3D. The data obtained showed that the model and the techniques used were effective for the isolation and characterization of EVs and for the identification of microRNA expression in different groups and time points. The expression of microRNA-140 in response to the inflammatory environment is performed by eqSMMSCs, and it was shown to be early in 3D cells and late in EVs from cells grown in 2D.