Biotransformação de ácidos hidroxicinâmicos por Micrococcus luteus TG3.30: uma abordagem bioquímica, genômica e in silico

Abstract

A valorização de compostos fenólicos derivados da biomassa lignocelulósica representa uma estratégia relevante para o desenvolvimento de processos sustentáveis associados à bioeconomia circular. Entre esses compostos, o ácido ferúlico destaca-se como precursor renovável para a produção de 4-vinilguaiacol (4VG), molécula aromática de interesse para as indústrias de alimentos, fragrâncias, cosméticos e química fina. Esta tese investigou a capacidade de Micrococcus luteus TG3.30 em converter ácido ferúlico em 4VG, integrando caracterização bioquímica, aplicação em hidrolisado fúngico, análise genômica, proteômica e modelagem in sílico. Inicialmente, foi realizada uma revisão crítica sobre compostos fenólicos derivados da lignina e suas aplicações tecnológicas. Em seguida, extratos enzimáticos de M. luteus TG3.30 foram obtidos e avaliados quanto à atividade descarboxilante sobre ácido ferúlico comercial, considerando diferentes frações celulares, tempos de reação e pH. A atividade foi predominantemente associada ao extrato intracelular, sendo 60 min e pH 6,5 definidos como condições adequadas para os ensaios. Posteriormente, hidrolisados fúngicos obtidos por fermentação em estado sólido de bagaço de cana-de-açúcar e farelo de trigo com Myceliophthora heterothallica e Myceliophthora thermophila foram utilizados como substratos para a conversão enzimática. Ambos os hidrolisados de 8 dias permitiram a formação de 4VG pelo extrato intracelular de M. luteus TG3.30, atingindo 49,67 mg L⁻¹ para M. heterothallica e 51,91 mg L⁻¹ para M. thermophila. O sequenciamento completo do genoma de M. luteus TG3.30 revelou um genoma de 2,58 Mb, com 72,92% de conteúdo GC, mas não identificou genes codificantes para ferulato descarboxilases canônicas. Diante disso, foram investigadas enzimas alternativas com atividade descarboxilase anotada ou domínios relacionados, incluindo hemQ, sucA, pyrF e panD. Análises proteômicas por LC-MS/MS e modelagem molecular indicaram a coproheme descarboxilase, codificada por hemQ, como candidata prioritária para a atividade observada. As predições in silico indicaram afinidade da enzima pelo ácido trans-ferúlico e sugeriram a participação de resíduos como His163, Tyr140, Trp188 e Phe142 na estabilização do substrato. Em conjunto, os resultados demonstram que M. luteus TG3.30 é capaz de converter ácido ferúlico em 4VG por um sistema enzimático intracelular, possivelmente associado a uma rota não canônica de descarboxilação. Esta tese contribui para ampliar o conhecimento sobre a biotransformação de ácidos fenólicos por actinobactérias ambientais e propõe uma abordagem integrada para valorização de resíduos lignocelulósicos e produção sustentável de compostos aromáticos de maior valor agregado.

The valorization of phenolic compounds derived from lignocellulosic biomass represents an important strategy for the development of sustainable processes aligned with the circular bioeconomy. Among these compounds, ferulic acid stands out as a renewable precursor to produce 4-vinylguaiacol (4VG), an aromatic molecule of interest to the food, fragrance, cosmetic, and fine chemical industries. This thesis investigated the ability of Micrococcus luteus TG3.30 to convert ferulic acid into 4VG by integrating biochemical characterization, application in fungal hydrolysates, genomic analysis, proteomics, and in silico modeling. Initially, a critical review was conducted on lignin-derived phenolic compounds and their technological applications. Subsequently, enzymatic extracts from M. luteus TG3.30 were obtained and evaluated for decarboxylating activity against commercial ferulic acid, considering different cellular fractions, reaction times, and pH conditions. The activity was mainly associated with the intracellular extract, and 60 min at pH 6.5 were selected as suitable conditions for the assays. Fungal hydrolysates obtained by solid-state fermentation of sugarcane bagasse and wheat bran with Myceliophthora heterothallica and Myceliophthora thermophila were then used as substrates for enzymatic conversion. Both 8-day hydrolysates supported 4VG formation by the intracellular extract of M. luteus TG3.30, reaching 49.67 mg L⁻¹ for M. heterothallica and 51.91 mg L⁻¹ for M. thermophila. Whole-genome sequencing of M. luteus TG3.30 revealed a 2.58 Mb genome with 72.92% GC content, but no genes encoding canonical ferulic acid decarboxylases were identified. Therefore, alternative enzymes annotated as decarboxylases or containing related domains were investigated, including hemQ, sucA, pyrF, and panD. LC-MS/MS-based proteomic analysis and molecular modeling indicated coproheme decarboxylase, encoded by hemQ, as the main candidate associated with the observed activity. In silico predictions suggested affinity between this enzyme and trans-ferulic acid and indicated the possible involvement of residues such as His163, Tyr140, Trp188, and Phe142 in substrate stabilization. Overall, the results demonstrate that M. luteus TG3.30 can convert ferulic acid into 4VG through an intracellular enzymatic system, possibly associated with a non-canonical decarboxylation route. This thesis expands the understanding of phenolic acid biotransformation by environmental actinobacteria and proposes an integrated approach for lignocellulosic waste valorization and sustainable production of high-value aromatic compounds.