Telócitos e células perissinápticas de Schwann: repercussão na junção neuromuscular em modelo experimental de lesão muscular

Abstract

A junção neuromuscular (JNM) é a região de comunicação entre o sistema nervoso periférico e o músculo estriado esquelético, composta por 3 elementos (tríade), o axônio do neurônio motor, o sarcolema da fibra muscular e as células perissinápticas de Schwann (CPS). Em 2009, um 4° elemento celular (kranócito) foi identificado nesta região caracterizado pelo encapsulamento da tríade, poucos autores consideraram este elemento e assim pouco se sabe sobre sua função. Nos últimos anos, um elemento celular de origem estromal foi identificado em diferentes tecidos, presente no interstício e caracterizado por suas projeções delgadas de comunicação, o telócito. Alterações na JNM como a lesão muscular, desencadeiam adaptações que podem influenciar negativamente sua estrutura. Diante disso, o objetivo do presente estudo consistiu em revelar as adaptações da JNM, em modelo experimental de lesão muscular em período agudo, e identificar os telócitos e inclui-lo como elemento desta região de forma inédita. Para o experimento, foram utilizados 60 ratos (75 dias) Wistar machos divididos em 5 Grupos: Controle (C) - não realizaram protocolo; Lesão Muscular (LM) 0h, 24h, 48h e 7d, foi realizado o protocolo de lesão muscular no músculo gastrocnêmio direito por meio de inserção de agulha. Após os períodos pós protocolo, os animais foram pesados, as amostras do músculo gastrocnêmio foram dissecadas, mensuradas, e processadas para as técnicas: de Microscopia de luz para análise dos núcleos celulares e tecido conjuntivo associado com a coloração de Hematoxilina e Eosina (HE) e Picrosirius Red (PS) respectivamente, onde foram mensuradas a área e a porcentagem da área; a técnica de imunomarcação foi empregada para a identificação e mensuração das regiões pré e póssinápticas e dos canais de cálcio (P/Q) e para identificação das CPS (S100β) e dos telócitos (CD34); o cultivo celular foi realizado para a diferenciação de telócitos e CPS e aplicação para citometria de fluxo; por fim, foi realizada a análise de expressão gênica (qPCR) para os genes de interesse. A massa corporal apresentou redução apenas no Grupo LM24h, em relação a massa muscular, o aumento foi progressivo em todos os grupos. Na microscopia de luz observou-se o acúmulo de núcleos e de tecido conjuntivo associado na região do ventre muscular nos grupos LM24h e LM48h. Quanto às análises morfo quantitativas, as regiões pré-sinápticas e os canais de cálcio apresentaram com sutil redução estrutural em 0h e 48h e aumento em 48h, já os receptores pós-sinápticos apresentaram redução progressiva. As CPS foram identificadas em todos os grupos experimentais e associadas aos receptores pós-sinápticos, assim como os telócitos de forma inédita. O cultivo celular foi realizado e as células de interesse foram utilizadas para a citometria de fluxo, onde as CPS puderam ser diferenciadas em relação aos telócitos. Na análise de expressão gênica observamos aumento para NG2 em 48h, para NRG1 em 48h e 7d e para Agrina aumento progressivo em 0h até 48h, e 7d. Concluímos que o protocolo proposto afetou diretamente estrutura neuromuscular, principalmente a região pós-sináptica. Os telócitos foram dentificados na região da JNM, o que comprova sua atuação na região de interesse, desta forma, frente as características e as descrições da literatura sobre as CPS e os kranócitos, pudemos estabelecer que os kranócitos devem ser considerados telócitos e definidos como 4° elemento desta região.

The neuromuscular junction (NMJ) is the region of communication between the peripheral nervous system and skeletal striated muscle, composed of three elements (triad): the motor neuron axon, the muscle fiber sarcolemma, and the perisynaptic Schwann cells (PSC). In 2009, a fourth cellular element (kranocyte) was identified in this region, characterized by the encapsulation of the triad. Few authors have considered this element, and thus little is known about its function. In recent years, a cellular element of stromal origin has been identified in various tissues, present in the interstitium and characterized by its thin communication projections: the telocyte. Alterations in the NMJ, such as muscle injury, trigger adaptations that can negatively influence its structure. Therefore, the objective of the present study was to reveal the adaptations of the NMJ in an experimental model of acute muscle injury, and to identify telocytes and include them as an element of this region for the first time. For the experiment, 60 male Wistar rats (75 days old) were divided into 5 Groups: Control (C) - did not perform the protocol; Muscle Injury (MI) 0h, 24h, 48h and 7d, the muscle injury protocol was conducted in the right gastrocnemius muscle using needle insertion. After the post-protocol periods, the animals were weighed, gastrocnemius muscle samples were dissected, measured, and processed for the following techniques: light microscopy for analysis of cell nuclei and associated connective tissue with hematoxylin and eosin (HE) and picrosirius red (PS) staining, respectively, where the area and percentage of the area were measured; the immunostaining technique was used to identify and measure the pre- and postsynaptic regions and calcium channels (P/Q), and to identify PSC (S100β) and telocytes (CD34); cell culture was performed for telocyte and PSC differentiation and application for flow cytometry; finally, gene expression analysis (qPCR) was performed for the genes of interest. Body mass showed a reduction only in the MI24h Group, whereas muscle mass, an increase that was progressive in all groups. Light microscopy revealed an accumulation of nuclei and associated connective tissue in the muscle belly region of the MI24h and MI48h groups. Quantitative morphological analyses revealed a subtle structural reduction in presynaptic regions and calcium channels at 0h and 48h, followed by an increase at 48h. Postsynaptic receptors showed a progressive reduction. PSCs were identified in all experimental groups and associated with postsynaptic receptors, as were telocytes for the first time. Cell culture was performed, and the cells of interest were used for flow cytometry, where PSCs could be differentiated from telocytes. Gene expression analysis showed an increase in NG2 at 48h, NRG1 at 48h and 7d, and a progressive increase in Agrin from 0h to 48h and 7d. We conclude that the proposed protocol directly affected the neuromuscular structure, especially the postsynaptic region. Telocytes were identified in the NMJ region, demonstrating their role in the region of interest. Therefore, given the characteristics and literature descriptions of PSCs and kranocytes, we can conclude that kranocytes should be considered telocytes and defined as the fourth element of this region.