Abordagens de engenharia metabólica e evolutiva para produção de d-ácido láctico em saccharomyces cerevisiae

Abstract

O ácido lático é um composto de alto valor agregado com ampla aplicação em indústrias alimentícia e cosmética, além de ser uma alternativa promissora para a produção de polímeros biodegradáveis, capazes de substituir materiais plásticos derivados do petróleo. Sua obtenção pode ocorrer por síntese química ou fermentação microbiana. A rota química gera uma mistura racêmica de isômeros, enquanto a produção microbiana permite a obtenção de um produto opticamente puro, formado por apenas um isômero (L ou D). A maioria dos microrganismos naturais produz o isômero L, mas a produção do isômero D é vantajosa para a síntese de polímeros heterogêneos (poli-ácido lático) combinando D-lactato e L-lactato. Este projeto utiliza estratégias de engenharia metabólica e evolução adaptativa para a produção de D-ácido lático pela levedura Saccharomyces cerevisiae. A levedura foi geneticamente modificada com a inserção de duas cópias do gene da lactato desidrogenase de Leuconostoc mesenteroides no genoma, utilizando CRISPR/Cas9, como parte do projeto temático FAPESP 2017/22401-8 – “Fruto-refinaria: processos de obtenção, métodos de caracterização e geração de produtos oriundos de resíduos da fruticultura”. Ensaios fermentativos demonstraram que a cepa modificada produziu 6 g/L de D-ácido lático. Por meio de evolução adaptativa, quatro diferentes populações de S. cerevisiae adquiriram alta tolerância a ácidos orgânicos após seleção em concentrações crescentes de ácido lático. Quatro populações evoluídas toleraram choques de até 15% de ácido lático por duas horas. O sequenciamento genômico dessas populações revelou mais de 230 mutações, incluindo alterações no gene PCK1, comum a todas as populações submetidas a diferentes estratégias de evolução adaptativa. Ensaios fenotípicos indicaram que uma das populações apresentou ganho de fitness sete vezes superior ao progenitor.

Lactic acid is a high-value compound with broad applications in the food and cosmetic industries. It also represents a promising alternative for the production of biodegradable polymers capable of replacing petroleum-derived plastics. Its production can occur via chemical synthesis or microbial fermentation. Chemical synthesis generates a racemic mixture of isomers, whereas microbial production allows for the generation of an optically pure product consisting of only one isomer (L or D). Most natural microorganisms produce the L isomer, but the production of the D isomer is advantageous for synthesizing heterogeneous polymers (polylactic acid) combining D-lactate and L-lactate. This project employs metabolic engineering and adaptive evolution strategies to produce D-lactic acid using the yeast Saccharomyces cerevisiae. The yeast was genetically modified by inserting two copies of the lactate dehydrogenase gene from Leuconostoc mesenteroides into its genome using CRISPR/Cas9 as part of the FAPESP thematic project 2017/22401-8 – "Fruit biorefinery: processes for obtaining, characterization methods, and generation of products derived from fruit industry residues." Fermentative assays showed that the engineered strain produced 6 g/L of Dlactic acid. Through adaptive evolution, four distinct populations of S. cerevisiae acquired high tolerance to organic acids after selection in increasing concentrations of lactic acid. These populations tolerated shocks of up to 15% lactic acid for two hours. Genomic sequencing of these populations revealed over 230 mutations, including alterations in the PCK1 gene, common to all populations subjected to different adaptive evolution strategies. Phenotypic assays indicated that one population exhibited a fitness gain seven times higher than the progenitor.