Efeitos da combinação de ácido cafeico, bevacizumabe e atezolizumabe sobre o carcinoma hepatocelular: uma abordagem in vitro

Abstract

A nível mundial, o câncer de fígado encontra-se entre os cânceres mais incidentes e mortais. O Carcinoma Hepatocelular (CHC), subtipo histológico mais comum da doença, apresenta um prognóstico desfavorável. Dentre as terapias vigentes para o CHC, encontram-se a combinação dos anticorpos monoclonais Atezolizumabe (ATZ) e Bevacizumabe (BVZ), que atuam modulando a resposta imune e angiogênese tumoral. Embora essas terapias tenham promovido um aumento na sobrevida dos pacientes, os benefícios clínicos são considerados modestos. Assim, a investigação da potencial cooperação entre compostos bioativos de alimentos – como o ácido cafeico (AC) - com esquemas de quimioterápicos e imunoterápicos são estimuladas na literatura, apesar de pouco exploradas. Além de apresentar efeitos antioxidantes, pró-oxidantes, antiproliferativos e pró-apoptóticos, o AC também atua sobre a angiogênese tumoral. Desse modo, o objetivo do trabalho foi avaliar se o AC promove a resposta antitumoral da imunoterapia por BVZ e ATZ em um modelo in vitro de CHC. Para tal, linhagens de células de CHC humano C3A/HepG2 e células estreladas hepáticas humanas ativadas LX2 foram cultivadas em placas ultra-low attachment para a formação dos esferoides (3D). Então, os esferoides foram tratados individualmente com ATZ (0, 0,93, 1,87, 3,65, 7,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, e 400 μM); BVZ (0, 3,65, 7,25, 12,5, 25, 50, e 100 μM) ou AC (0, 32.81, 65.62, 131.25, 262.5, 525, 1050, 2100 e 4200 μM) durante 24 e 48 horas. Em seguida, foi realizado o ensaio de viabilidade celular (MTT) para o cálculo do half maximal effective concentration (EC50) de cada substância. As células foram tratadas com a combinação de AC + ATZ + BVZ em concentrações equivalentes a 1/6 (878 + 49 + 16 µM, respectivamente) e 1/10 (527 + 29 + 9 µM) do EC50 determinado, aproximando-se de concentrações fisiologicamente plausíveis. Após o tratamento combinado durante 24 e 48h, foi realizado novamente o ensaio de viabilidade celular e o Índice Combinatório foi calculado. Os resultados apontam para uma maior eficácia da imunoterapia [EC50=294 µM (ATZ) e 94 µM (BVZ)] em reduzir a viabilidade dos esferoides em comparação ao AC (EC50=5266 µM). Ademais, o AC não promoveu os efeitos dos anticorpos na redução da viabilidade de esferoides C3A/LX2 e o cálculo do Índice Combinatório revelou um efeito antagônico entre os compostos (IC>1,1). Tais achados contrastam com dados prévios da literatura acerca dos efeitos do AC sobre o CHC, baseados em modelos bidimensionais, reforçando a necessidade da aplicação de modelos mais robustos na investigação pré-clínica de candidatos às terapias de combinação.

Worldwide, liver cancer ranks among the most prevalent and deadly types of cancer. Hepatocellular carcinoma (HCC), the most common histological subtype of the disease, presents a poor prognosis. Among current therapies for HCC is the combination of the monoclonal antibodies Atezolizumab (ATZ) and Bevacizumab (BVZ), which act by modulating the immune response and tumor angiogenesis. Although these therapies have improved patient survival, their clinical benefits are considered modest. Therefore, the potential synergistic effects of food-derived bioactive compounds - such as caffeic acid (CA) - when combined with chemotherapy and immunotherapy regimens have been increasingly discussed in the literature, although they remain underexplored. In addition to its antioxidant, pro-oxidant, antiproliferative, and pro-apoptotic activities, CA also targets tumor angiogenesis. Thus, this study aimed to evaluate whether CA enhances the antitumor effects of BVZ and ATZ immunotherapy in an in vitro HCC model. For this purpose, human HCC cells (C3A/HepG2) and activated human hepatic stellate cells (LX2) were co-cultured in ultra-low attachment plates to generate three-dimensional (3D) spheroids. The spheroids were then treated individually with ATZ (0, 0.93, 1.87, 3.65, 7.25, 12.5, 25, 50, 100, 200, and 400 μM); BVZ (0, 3.65, 7.25, 12.5, 25, 50, and 100 μM); or CA (0, 32.81, 65.62, 131.25, 262.5, 525, 1050, 2100, and 4200 μM) for 24 and 48 hours. A cell viability assay (MTT) was then performed to determine the half maximal effective concentration (EC50) of each compound. Then, cells were treated with the combination of CA + ATZ + BVZ using concentrations equivalent to 1/6 (878 + 49 + 16 μM, respectively) and 1/10 (527 + 29 + 9 μM) of the predetermined EC50 values, reaching physiologically plausible concentrations. After combined treatment for 24 and 48 hours, cell viability was reassessed, and the Combination Index was calculated. The results indicated greater efficacy of the immunotherapy [EC50=294 µM (ATZ) e 94 µM (BVZ)] in reducing spheroid viability compared to CA (EC50=5266 µM). Furthermore, CA did not enhance the effects of the antibodies in reducing the viability of C3A/LX2 spheroids, and the Combination Index indicated an antagonistic interaction between the compounds (CI>1.1). These findings contrast with previous reports on CA effects in HCC, which are primarily based on two dimensional models, underscoring the importance of applying more physiologically relevant models in the preclinical evaluation of combination therapy candidates.