Os efeitos dos compostos fenólicos ácido siríngico e ácido vanílico sobre os parâmetros cinéticos e de termoestabilidade de uma endoxilanase recombinante de Myceliophthora heterothallica

Abstract

O uso de técnicas moleculares na produção, análise e purificação de enzimas tem sido um grande aliado em pesquisas científicas e industriais permitindo um estudo amplo e detalhado sobre as condições químicas atuantes sobre as enzimas e fatores de aplicabilidade. A enzima estudada no presente trabalho consiste de uma endoxilanase recombinante do fungo termofílico Myceliophthora heterotallica e expressa na levedura Pichia pastoris, capaz de hidrolisar algumas ligações da xilana, o principal componente da hemicelulose. A xilanase pode ser utilizada em várias áreas industriais para o beneficiamento e aproveitamento de subprodutos lignocelulósicos da produção agrícola, produzindo compostos químicos de alto valor agregado. Durante o processo de tratamento ou pré-tratamento dessas biomassas lignocelulósicas é comum a liberação de compostos fenólicos que muitas vezes são capazes de interferir negativamente na ação enzimática das xilanases e outras enzimas de degradação da fibra vegetal. Sendo assim, nosso objetivo foi estudar os efeitos dos compostos fenólicos ácido vanílico e ácido siríngico na cinética enzimática da endoxilanasse recombinante citada acima. Para o estudo foi realizada a purificação dessa enzima recombinante; após a purificação a enzima foi incubada por 30 minutos com os compostos fenólicos citados em uma concentração de 20 mM de fenólicos. Com essas amostras foram realizadas diversas reações enzimáticas a uma temperatura de 60 °C por 5 minutos em uma concentração crescente de substrato para que então fosse realizado o cálculo dos parâmetros cinéticos e a montagem do gráfico da reação. Os valores da Constante de Michaelis Km e da taxa ou velocidade máxima de reação Vmax foram obtidos por ajuste não linear de parâmetros no programa QtiPlot versão 0.9.9.11 (©Ion Vasilief 2004–2017) para Linux. Para os parâmetros de estabilidade térmica foram utilizadas amostras preparadas da mesma maneira, incubadas em temperaturas de 50, 60, 70 e 75ºC por 15, 30, 60, 120 e 180 minutos e deixadas overnight a uma temperatura de 4 °C para restabelecimento de qualquer desdobramento reversível nas estruturas secundárias e terciárias. A atividade foi determinada e comparada com uma amostra respectiva que não foi exposta a incubação térmica. A temperatura ótima foi determinada pela dosagem da atividade enzimática variando a temperatura de incubação da amostra enzimática com o substrato, em 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 95 ºC durante 10 minutos. A partir dos resultados obtidos foi confeccionado o gráfico de Arrhenius. O trabalho concluiu que os compostos ácidos siríngico e ácido vanílico impactaram positivamente a cinética da xilanase, aumentando a Vmax e os índices de cooperatividade; em relação à temperatura ótima não houve diferenças significativas relacionadas ao controle assim como na termoestabilidade, apesar da atividade residual ter apresentado um aumento.

The use of molecular techniques in the production, analysis and purification of enzymes has been a great ally in scientific and industrial processes, allowing a wide and detailed study of the conditions acting on enzymes and applicability factors. The enzyme studied in the present work consists of a recombinant endoxylanase from the thermophilic fungus Myceliophthora heterotallica and expressed in the yeast Pichia pastoris, capable of hydrolyzing some xylan bonds, the main component of hemicellulose. Xylanase can be used in various industrial areas for the improvement and use of lignocellulosic by-products from agricultural production, producing chemical compounds with high added value. During the treatment or pre-treatment process of these lignocellulosic biomasses, it is common to release phenolic compounds that are often capable of negatively interfering with the enzymatic action of xylanases and other degradation enzymes. Therefore, this study aims to study the effects of vanillic acid and syringic acid on the enzymatic kinetics of a recombinant endoxylanase isolated from Myceliophthora thermophila. For the study, the purification of this recombinantly expressed enzyme was performed, after purification of the enzyme, it was incubated for 30 minutes with the aforementioned phenolic compounds at a concentration of 20 mM of phenolics. With this sample, enzymatic reactions were completed at a temperature of 60 °C for 5 minutes in an increasing concentration of substrate so that the calculation of the kinetic parameters and the assembly of the reaction graph could be performed. The values of the Michaelis Constant Km and the maximum reaction rate or speed Vmax were obtained in the QtiPlot program version 0.9.9.11 (© Ion Vasilief 2004–2017) for Linux. For stability parameters were used, prepared in the same way, they were incubated at temperatures of 50, 60, 70 and 75ºC for 15, 30, 60, 120 and 180 minutes and left overnight at a temperature of 4 °C for to have the re-establishment of any reversible unfolding in the secondary and tertiary structures, an activity provided and compared with an offer that has not been exposed to thermal incubation. For the determination of the optimum temperature, it was provided by the dosage of the enzymatic activity, varying the incubation temperature of the enzymatic sample with the substrate, at 40, 50, 60, 70, 80, 90 and 95 ºC for 10 minutes. From the results obtained, the Arrhenius graph was constructed. The work concluded that the compounds syringic acid and vanillic acid positively impacted the xylanase kinetics, increasing the Vmax and the cooperativity indices, in relation to the optimal temperature there were no major changes in the control as well as in thermostability, although the residual activity showed an increase in the residual activity.