DEGRADADORES DE HISTONA DEACETILASE PARA INDUÇÃO DE HEMOGLOBINA FETAL

Abstract

A indução da produção de hemoglobina fetal (HbF) é capaz de inibir a polimerização da hemoglobina S (HbS) presente na anemia falciforme e minimizar as manifestações clínicas da doença. A modulação de enzimas epigenéticas responsáveis pela repressão do gene HBG1/2, como as histonas deacetilases 1 e 2, apresentam-se como uma estratégia promissora para indução de HbF. Os objetivos do trabalho foram a avaliação farmacológica de moléculas degradadoras de HDAC 1 e 2 para indução de HbF. As células utilizadas para quantificação de degradação de HDACs 1 e 2 foi a HCT-116 e o ensaio foi realizado através de western blot quantitativo. As células utilizadas para indução de HbF foi a HUDEP-2, em que se utilizou qPCR para quantificação de mRNA de HBG1/2 e citometria de fluxo para avaliação da porcentagem de células positivas para HbF. Foram planejadas e sintetizadas novas moléculas capazes de promover a degradação seletiva das HDACs 1 e 2 através da formação de um complexo ternário entre HDACs- 1/2 e a enzima E3-ligase denominada cereblon. A formação desse complexo leva a ubiquitinação das enzimas alvo e posterior degradação via proteosoma. Treze moléculas foram sintetizadas e avaliadas em células HCT-116 em relação à degradação das HDACs 1, 2 e 3, resultando em três promissores compostos (I, II e III) com diminuição seletiva dos níveis de HDAC-1 e valor de DC50 de 2,5 μM. O composto III foi então selecionado para avaliação em células HUDEP-2, nas concentrações de 500nM e 750nM, e tempo de tratamento de 72h e 96h. A análise de qPCR mostrou um aumento significativo nos níveis de mRNA de HBG1/2, sendo este de 26,9x e 35,5x nas concentrações de 500nM e 750nM, respectivamente, em 72h quando comparados com o controle (CTRL = 0,027 ± 0,006 unidades arbitrárias (u.a.) vs 500nM = 0,73 ± 0,25 u.a. e 750nM = 0,96 ± 0,11 u.a., p < 0,0001, n = 4). Em 96h, o aumento foi de 34x e 44,5x, respectivamente, (CTRL = 0,034 ± 0,012 u.a. vs 500nM = 1,12 ± 0,35 u.a. e 750nM = 1,52 ± 0,37 u.a., p < 0,0001, n = 4). Após o tratamento, as células foram marcadas utilizando-se anticorpos anti-HbF para quantificação da porcentagem de células positivas para HbF, onde foi observado um aumento de 7,5x e 9x nas concentrações de 500nM e 750nM, respectivamente, em 72h (CTRL = 0,58 ± 0,15 % vs 500nM = 4,43 ± 0,88 % e 750nM = 5,29 ± 1,52 %, p < 0,0001, n = 4), enquanto que o aumento em 96h foi de 8,3x e 10,6x, respectivamente (CTRL = 0,65 ± 0,15 % vs 500nM = 5,44 ± 0,79 % e 750nM = 6,89 ± 1,05 %, p < 0,0001, n = 4). O tratamento realizado com hidroxiuréia, fármaco padrão, à 100 μM, resultou num aumento máximo dos níveis de mRNA de HBG1/2 de, aproximadamente, 10x em 72h e num aumento na porcentagem de células HbF-positivas de 8,5x e 8,9x em 72h e 96h, respectivamente (CTRL 72h = 0,66 ± 0,23% vs HU 72h = 5,65 ± 0,59%, CTRL 96h = 0,64 ± 0,15% vs HU 96h = 5,73 ± 0,52%; p < 0,0001, n = 2). Os dados obtidos demonstram que as moléculas sintetizadas apresentam seletividade de degradação contra HDAC-1, o que ainda não havia sido descrito na literatura. Além disso, a molécula III demonstrou ser mais efetiva quando comparada a HU, com atividade de indução da expressão do gene HBG1/2 2,6x maior, em uma concentração 200x menor. Estes resultados dão suporte para a continuação dos estudos da molécula III em ensaios pré-clínicos como potencial indutora de HbF para tratamento de hemoglobinopatias.