Publicação: Caracterização funcional de uma nova proteína autotransportadora identificada em um isolado de Escherichia coli enteropatogênica atípica do sorotipo O2:H16
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Data
Autores
Orientador
Hernandes, Rodrigo Tavanelli 
Coorientador
Elias Junior, Waldir Pereira
Pós-graduação
Biologia Geral e Aplicada - IBB 33004064080P3
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
A doença diarreica é uma das principais causas de mortalidade entre crianças com até cinco anos de idade, sendo que dentre os principais causadores dessa doença está a Escherichia coli diarreiogênica (DEC). E. coli enteropatogênicas (EPEC) é um dos seis patotipos de DEC, sendo seu principal fenótipo de virulência a formação da lesão attaching and effacing, que se caracteriza pela destruição das microvilosidades da célula hospedeira por meio do recrutamento de F-actina polimerizada no local de aderência, levando à formação de uma estrutura semelhante a um pedestal. De acordo com a presença ou ausência do operon bfp, os isolados de EPEC podem ser classificados como típicos (tEPEC) ou atípicos (aEPEC), respectivamente. Estudos anteriores demonstraram que aEPEC é o principal patotipo de E. coli diarreiogênica isolado no Brasil, bem como a associação de sorotipos específicos, incluindo o sorotipo O2:H16, com surtos diarreicos. Uma análise genética comparativa de 106 aEPEC sequenciadas, incluindo 7 aEPEC do sorotipo O2:H16, revelou um conjunto de 31 genes detectados exclusivamente neste sorotipo. Dentre esses genes, identificamos um responsável por codificar uma proteína autotransportadora (AT) não caracterizada. Portanto, o objetivo do presente estudo foi caracterizar molecular e fenotipicamente esta nova proteína AT. O gene que codifica a nova proteína AT foi clonado no vetor pBAD/Myc His A, gerando o plasmídeo recombinante pIC, que foi transformado na E. coli MS427, uma variante de MG1655 deletada no fator de agregação flu. Este isolado foi utilizado em ensaios de autoagregação realizados em caldo
infusão cérebro coração e ensaio de formação de biofilme realizado em placas de poliestireno com 24, 48 e 72 horas de incubação em caldo de lisogenia. Além disso, a região responsável por codificar o domínio passageiro (aminoácidos 22 a 471) da nova proteína AT foi clonada no vetor pET-28a, que foi transformado na BL21(DE3). A proteína recombinante fusionada à cauda de histidina foi expressa através de indução por isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo, purificada por cromatografia de afinidade com metal imobilizado e utilizada para a produção de um soro policlonal específico em coelho. Este soro foi posteriormente utilizado para confirmar a produção da nova AT na superfície das bactérias MS427(pIC) e selvagem BA92 via microscopia eletrônica de transmissão (MET) com imunomarcação e para avaliar a sua ligação a macromoléculas da matriz extracelular. Esses experimentos foram realizados utilizando 1 µM do domínio passageiro recombinante purificado contra 1 µg dos colágenos I, III, IV e V, fibronectina celular e plasmática, laminina, fibrinogênio e vitronectina. Ensaios de autoagregação mostraram que o clone contendo o plasmídeo com o gene responsável pela síntese da nova proteína AT – MS427(pIC), promoveu um forte fenótipo de autoagregação, resultando em diferença significativa a partir de 20 minutos (P < 0,001) quando comparado a MS427(pBAD). A formação de biofilme em poliestireno também foi significativamente aumentada (P < 0,0001) na MS427(pIC) quando comparada com a bactéria controle carregando o vetor pBAD/Myc-His A vazio. Além disso, o domínio passageiro recombinante purificado se ligou ao fibrinogênio (P = 0,0003), fibronectina plasmática e celular (P < 0,0001), colágeno tipo I (P = 0,0097), III e V (P < 0,0001) e laminina (P = 0,0003). Por fim, a imunomarcação visualizada por MET mostrou a localização da proteína AT como um componente proteico da membrana externa bacteriana. Em conclusão, demonstramos que a nova proteína AT caracterizada no presente estudo promove autoagregação, formação de biofilme em poliestireno e, devido a capacidade de se ligar a múltiplas moléculas de matriz extracelular, nós a denominamos Ema: Extracellular Matrix-binding Autotransporter.
Resumo (inglês)
Diarrheal diseases are among the main causes of mortality in children up to 5 years of age, and the diarrheagenic Escherichia coli (DEC) pathotypes are frequently associated as the causative agents of this pathology. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) is one of the six DEC pathotypes, characterized by its ability to induce the attaching and effacing lesion, characterized by the destruction of host cell microvilli through the recruitment of polymerized F-actin at the site of adherence, leading to the formation of a pedestal-like structure. According to the presence or absence of the bfp operon, EPEC isolates can be classified as typical (tEPEC) or atypical (aEPEC), respectively. Previous studies have shown that EPEC is the main pathotype of diarrheagenic E. coli reported in Brazil, as well as the association of specific serotypes, including serotype O2:H16, with diarrheal outbreaks. A comparative genetic analysis of 106 sequenced aEPEC, including 7 aEPEC of serotype O2:H16, revealed a set of 31 genes detected exclusively in this serotype. Among them, we identified one responsible to encode an uncharacterized autotransporter protein (AT). Therefore, the objective of the present study was to characterize this new AT protein molecularly and phenotypically. The gene encoding the new AT protein was cloned into the pBAD/Myc-His A vector, generating the recombinant plasmid pIC, which was transformed into E. coli MS427, a variant of MG1655 deleted in the aggregation factor flu. This isolate was used in autoaggregation assays carried out in brain heart infusion broth and biofilm formation assay carried out in polystyrene plates with 24, 48 and 72 hours of incubation in lysogeny broth. Furthermore, we cloned the region responsible for encoding the passenger domain (amino acids 22 to 471) of the new AT protein into the pET-28a vector, which was transformed into BL21(DE3). The recombinant protein carrying histidine tail was expressed by Isopropyl-beta-D-thiogalactoside induction, purified by immobilized metal affinity chromatography and used to produce a rabbit serum. This serum was subsequently used to confirm the production of the new AT on the surface of MS427(pIC) and wild-type BA92 bacteria via immunolabeled transmission electron microscopy (TEM) and to evaluate its binding to extracellular matrix macromolecules. These experiments were carried out using 1 µM of the purified recombinant passenger domain against 1 µg of collagens I, III, IV and V, cellular and plasmatic fibronectin, laminin, fibrinogen and vitronectin. Autoaggregation assays showed that the clone containing the plasmid with the gene responsible for the synthesis of the new AT protein – MS427(pIC), promoted a strong autoaggregation phenotype, resulting in a significant difference after 20 minutes (P < 0.001) when compared to MS427(pBAD). Biofilm formation on polystyrene was also significantly increased (P < 0.0001) in MS427(pIC) when compared to control bacteria carrying the empty pBAD/Myc-His A vector. Furthermore, the purified recombinant passenger domain bound to fibrinogen (P = 0,0003), plasma and cellular fibronectin (P < 0,0001), type I (P = 0,0097), III and V collagen (P < 0.0001) and laminin (P = 0.0003). Finally, TEM immunolabeling localized the protein as a proteinaceous component of the bacterial outer membrane. In conclusion, we demonstrated that the new AT protein characterized in the present study promotes self-aggregation, biofilm formation on polystyrene and, due to its ability to bind to multiple extracellular matrix molecules, we named it Ema: Extracellular Matrix-binding Autotransporter.
Descrição
Palavras-chave
EPEC atípica, Patogenicidade bacteriana, Proteínas autotransportadoras, Virulência
Idioma
Português
