Efeitos de um novo ciclofosfato à base de cálcio, associado ou não ao flúor, sobre a viabilidade, metabolismo e estrutura de biofilmes de interesse cardiogênico in vitro

Abstract

Esse estudo teve o objetivo de avaliar o efeito de um novo ciclofosfato à base de cálcio (TMPCa), combinado ou não ao fluoreto (F), sobre a composição microbiana, metabolismo e estrutura de biofilmes mistos de Streptococcus mutans e Candida albicans formados in vitro. A síntese do TMPCa ocorreu a partir de um trimetafosfato de sódio (TMP), sendo realizada por meio de cromatografia. O composto foi caracterizado por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de raios X por dispersão em energia. A avaliação do efeito antibiofilme do composto ocorreu de acordo com os seguintes grupos experimentais: 1% de TMP, com ou sem 1100 ppm F; 1% de TMPCa, com ou sem 1100 ppm de flúor (F). Também, foi testada solução contendo 1100 ppm F (controle positivo), além de saliva artificial (controle negativo, CLT). Cepas de S. mutans e C. albicans foram cultivadas em saliva artificial. Os biofilmes formados no fundo de poços de placas de microtitulação foram tratados três vezes (72, 78 e 96 horas após o início da formação), por um minuto. Após esse período, foram realizadas análises de quantificação de células cultiváveis pela contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs), avaliação da produção de biomassa total (teste do cristal violeta) e atividade metabólica dos biofilmes (teste do XTT). O biofilme teve sua estrutura analisada por MEV. Os dados foram submetidos à ANOVA, seguido pelo teste de Student-Newman-Keuls (p<0,05). Observou-se por MEV granulações pequenas e regulares para todos os grupos analisados (i.e., TMP e TMPCa), enquanto nos espectrogramas obtidos pelo EDS, foram observados picos de sódio (Na) para o TMP, além de picos de O e fósforo P comuns aos dois compostos. Houve também a presença de picos característicos de cálcio (Ca) para o composto TMPCa. Com relação aos ensaios de efeito antibiofilme do composto, nenhum tratamento foi capaz de reduzir as UFCs de C. albicans em comparação ao CTL. Além disso, observou-se que 1% de TMPCa levou a UFCs deste microrganismo significativamente maiores que o grupo 1100 ppm F. Nenhum tratamento levou a reduções significativas nas UFCs de S. mutans, sendo todos os grupos semelhantes entre si. O grupo 1% de TMPCa, com F, apresentou a maior produção de biomassa, sem diferença significativa do grupo 1%TMPCa. Biofilmes tratados com 1% de TMPCa apresentou o maior metabolismo, seguido dos tratados com 1% de TMPCa, com F. A análise de MEV, os biofilmes mantiveram a estrutura característica, com aglomerados de cocos e hifas, independentemente da presença de F ou do composto analisado. Pode-se concluir que o processo de síntese levou à produção de um novo composto à base de cálcio, o qual, principalmente combinado com o F, afetou a composição microbiana e metabolismo dos biofilmes analisados.

This study aimed to synthesize and evaluate the effect of a new calcium-based cyclo-triphosphate (TMPCa), combined or not with fluoride (F), on the microbial composition, metabolism, expression of extracellular matrix components, and structure of dual-species biofilms of Streptococcus mutans and Candida albicans formed in vitro. TMPCa synthesis was carried out from sodium trimetaphosphate (TMP) through chromatography. The compound was characterized by scanning electron microscopy (SEM) and energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS). The antibiofilm effect of the compound was evaluated according to the following experimental groups: 1% TMP, with or without 1100 ppm F; 1% TMPCa, with or without 1100 ppm F. A solution containing 1100 ppm F (positive control) and artificial saliva (negative control) were also tested. S. mutans ATCC 25175 and C. albicans ATCC 10231 strains were cultured to obtain concentrations of 108 and 107 cells/mL, respectively, in artificial saliva. Biofilms formed at the bottom of microplate wells were treated three times (72, 78, and 96 hours after the start of formation) for one minute. After this period, analyses of quantification of cultivable cells by colony-forming unit (CFU) counting, evaluation of total biomass production (crystal violet test), biofilm metabolic activity (XTT test). Furthermore, the biofilm structure was analyzed by SEM. The data were submitted to ANOVA followed by the Student-Newman-Keuls test, adopting p<0.05. SEM revealed small and regular granules for all analyzed groups (i.e., TMP and TMPCa), while in the EDS spectrograms, Na peaks were observed for TMP, in addition to O and P peaks common to both compounds. There was also the presence of characteristic Ca peaks for the TMPCa compound. Regarding the antibiofilm effect assays of the compound, no treatment was able to reduce the CFUs of C. albicans compared to the CTL. Furthermore, it was observed that 1% TMPCa led to significantly higher CFUs of this microorganism than the 1100 ppm F group. None of the treatments resulted in significant reductions in S. mutans CFUs, with all groups being similar to each other. The group 1% TMPCa with F presented the highest biomass production, without significant difference from the 1% TMPCa group. Biofilms treated with 1% TMPCa presented the highest metabolism, followed by those treated with 1% TMPCa with F. SEM analysis the biofilms maintained the characteristic structure, with clusters of cocci and hyphae, regardless of the presence of F or the compound analyzed. In conclusion, It can be concluded that the synthesis process led to the production of a new calcium-based compound, which, mainly combined with F, affected the microbial composition and metabolism of the biofilms analyzed.