Identification of novel coding sequences associated with seasonality and water restriction imposition in Eucalyptus grandis by mass spectrometry

Abstract

Understanding how plants cope with current climate change and escalating frequency of drought events is crucial for agriculture. Among the plant species of economic importance, Eucalyptus species are widely cultivated for their several industrial applications. However, the current negative effects of changing climate may impose additional challenges on Eucalyptus plant adaptability and development. In this scenario, the study of proteins can provide essential insights into how plants regulate many biological processes under such conditions. Here, we use proteomics, a cutting-edge technology that uses mass spectrometry to identify proteins by correlating known virtual spectra against experimental spectra acquired from large-scale analyses of protein mixtures. We also use a proteogenomics approach that can identify novel peptides not initially predicted by conventional proteomics workflows in the Eucalyptus grandis proteome. First, our goal was to identify and validate novel peptide forms from E. grandis stem samples using a dedicated proteogenomics workflow, which consisted of spectral correlations against modified RNA databases and a de novo peptide sequencing approach. Later, this strategy was applied on a broader scale to identify novel peptide forms in E. grandis leaf samples subjected to the effect of seasonality and water restriction imposition. Known protein and novel peptide identifications provided important insights on how the leaf proteome profile of E. grandis trees changed over different seasons of the year, as well as under water restriction imposition. Those novel peptide identifications, mainly related to the photosynthesis process, decreased the protein stability by altering the quantitative change upon ΔΔG values and non-covalent interactions. Validation of novel identifications was carried out using either Multiple Reaction Monitoring (MRM) or Parallel Reaction Monitoring (PRM) targeted assays that provided further mass spectrometry support for the existence of the novel peptide identifications.

Compreender como as plantas lidam com as atuais mudanças climáticas e a crescente frequência de eventos de seca é crucial para a agricultura. Dentre as espécies vegetais de importância econômica, espécies de Eucalyptus são amplamente cultivadas por suas diversas aplicações industriais. No entanto, os atuais efeitos negativos das mudanças climáticas podem impor desafios adicionais à adaptabilidade e desenvolvimento de plantas de eucalipto. Nesse cenário, o estudo de proteínas pode fornecer insights essenciais sobre como as plantas regulam muitos processos biológicos sob tais condições. Aqui, usamos a proteômica, uma tecnologia de ponta que usa espectrometria de massa para identificar proteínas por meio da correlação entre espectros virtuais conhecidos e espectros experimentais adquiridos a partir de análises em larga escala de amostras proteicas. Também usamos uma abordagem de proteogenômica que pode identificar novos peptídeos não previstos inicialmente por fluxos de trabalho de proteômica convencionais no proteoma de Eucalyptus grandis. Inicialmente, nosso objetivo foi identificar e validar novas sequências de peptídeos em amostras caulinares de E. grandis usando um fluxo de trabalho de proteogenômica dedicado que consiste em correlações espectrais contra bancos de dados modificados de RNA e uma abordagem de sequenciamento de novo. Posteriormente, essa estratégia foi aplicada em larga escala para a identificação de novas formas peptídicas em amostras de folhas de E. grandis submetidas ao efeito da sazonalidade e da imposição de restrição hídrica. Proteínas conhecidas e novas identificações de peptídeos forneceram importantes insights sobre a alteração do proteoma foliar de árvores de E. grandis ao longo de diferentes estações do ano, bem como sob a imposição de restrição hídrica. Essas identificações de peptídeos novos, principalmente relacionadas ao processo de fotossíntese, diminuíram a estabilidade da proteína por alterar valores quantitativos de ΔΔG e interações não-covalentes. A validação de novas identificações peptídicas foi realizada por ensaios direcionados de Monitoramento de Reação Múltipla (MRM) ou Monitoramento de Reação Paralela (PRM) que forneceram suporte adicional de espectrometria de massa para a existência das novas sequências peptídicas identificadas.