O papel dos miRNA na infecção de leucócitos esplênicos de cão por Leishmania Infantum

Abstract

A leishmaniose visceral canina (LV) no Brasil representa um grave problema de saúde pública. Na LV a supressão imune celular é determinante da progressão da doença. Estudos mostraram que a regulação da resposta imune depende de miRNAs. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos miRNAs em leucócitos esplênicos (LE) de cães naturalmente infectados por L. infantum. Este estudo foi realizado em Araçatuba, região endêmica para LV canina (LVC). Um grupo de 4 cães saudáveis e 8 cães com LVC foi estudado. O RNA foi extraído do LE usando o Kit Mirvana (Invitrogen™) de acordo com as recomendações do fabricante. O RNA foi quantificado usando um fluorômetro (Qubit 3.0, Invitrogen™) o grau de pureza realizado por eletroforese capilar (Bioanalyser, Agilent ™), as amostras foram então armazenadas a -80°C. O miRNA foi preparado para o microarranjo usando o FlashTag Biotina HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix ™). O microarranjo foi realizado usando o Affymetrix ™ miRNA 4.1 Strip de acordo com as recomendações do fabricante. A produção de cDNA foi realizada usando o kit miScript RT II (Qiagen™). Os miRNAs diferencialmente expressos foram validados por qPCR utilizando iniciadores para miRNAs de cães inventariados (Qiagen™) de acordo com recomendação do fabricante. Os miRNAs validados foram analisados no programa Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Qiagen™). Após a análise das vias, os LE de cães infectados foram transfectados com miR21 usando miScript miRNA Mimics e Inhibitor (Qiagen™) de acordo com as recomendações do fabricante. Após a transfecção, o factor de transcrição T-bet e GATA 3 e a carga parasitária foi avaliada por citometria de fluxo e a IL-12 foi quantificada por ELISA Kit (R & D Systems™). A análise do microarray foi realizada no Expression Console, no Transcriptome Analysis Console (Affymetrix™) por ANOVA, qPCR foi analisada pelo teste de Mann-Whitney, a via canônica de miRNA diferentemente expressa em IPA com o teste de Fisher, o fator de transcrição, carga parasitária e expressão de IL-12 foi analisada pelo teste de Friedman, foi utilizado o nível de significância de p<0,05. Verificou-se que 7 miRNAs tiveram expressão alterada em cães infectados em comparação com cães saudáveis: miR-148a, miR-21, miR-7, miR-615 foram “upregulated” e miR-150, miR-125a e miR-125b foram “downregulated”. O miR148a, miR615 e miR21 validaram os resultados do microarranjo. O IPA mostrou 114 vias reguladas por esses miRNAs, incluindo vias que regulam a imunidade. Após a transfecção inibimos o miRNA 21 e observamos um aumento de IL-12, da razão Th1 e Th2 e uma diminuição da carga parasitária. Concluímos, que o miR 21 interfere na resposta imunológica de cães infectados por L. infantum, inibindo a resposta do tipo celular. Essas informações podem ajudar na identificação de alvos terapêuticos na LVC.

Canine visceral leishmaniasis (VL) in Brazil represents a serious public health problem. In VL cellular immune suppression is determinant of disease progression. Studies have shown that the regulation of the immune response depends on miRNAs. The objective of this study was the characterization of the miRNAs in spleen leukocytes (SL) from dogs naturally infected by L. infantum. This study was carried out in Araçatuba, an endemic region for canine LV (LVC). A group of 4 healthy dogs and 8 dogs with VL was studied. Total RNA was extracted from SL using Mirvana Kit (Invitrogen®) according to manufacturer’s recommendations Total RNA was quantified using a fluorometer (Qubit 3.0, Invitrogen®) the degree of purity performed by capillary electrophoresis (Bioanalyser, Agilent®), the samples were then stored at -80°C. Total RNA was prepared for the microarray using the FlashTag Biotin HSR RNA Labeling Kit (Affymetrix®). The microarray was performed using the Affymetrix ™ miRNA 4.1 Strip according to manufacturer’s recommendations. cDNA production was performed using the miScript RTII kit (Qiagen®). Differentially expressed miRNAs were validated by qPCR was performed using the inventoried dog miRNAs (Qiagen®) and SYBR Green (kit miScript SYBR Green PCR, Qiagen®), according to the manufacturer's recommendation. The validated miRNAs were analyzed in the program Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen®). After analysis of the pathways, then the LS from infected dogs were transfected with miR21 using miScript miRNA Mimics and Inhibitor (Qiagen®) according to manufacturer's recommendations. After the transfection LE the transcription factor T-bet and GATA 3, parasite load were measured by flow cytometry and IL-12 was quantified by ELISA Kit (R&D Systems®). The analyses of microarray was performed on Expression Console, Transcriptome Analysis Console (Affymetrix®); ANOVA, qPCR validation data was analyzed by Mann-Whitney test, the canonical pathway of miRNA differentially expressed in IPA with the Fisher test, the transcription factor, parasite load and expression of IL-12 was analysed by Friedman test, with the level of significance of p <0.05. It was found that 7 miRNAs had altered expression in infected dogs compared to healthy dogs: miR148a, miR21, miR7, miR615 were upregulated and miR150, miR125a and miR125b were downregulated. MiR148a, miR615 and miR21 validated the results of the microarray. The IPA showed 114 pathways regulated by these miRNAs, including pathways which regulate immunity. After transfection, the miR21 inhibitors increased T-bet and IL12 and decreased parasitic load. We conclude that miR 21 interferes in the immune response of dogs infected with L. infantum, inhibiting the cell type response. This information can assist in the identification of therapeutic targets in LVC.