Avaliação do potencial de lipossomas funcionalizados com transferrina dispersos em hidrogéis mucoadesivos para administração nasal de temozolomida no tratamento do glioblastoma

Abstract

O glioblastoma (GBM) é um tumor cerebral sólido difuso de alta agressividade. A temozolomida (TMZ), único fármaco disponível para o tratamento, torna-se pouco eficaz devido à baixa distribuição cerebral, visto que é um pró-fármaco que se hidrolisa ao cátion metildiazônico, metabólito ativo, em pH fisiológico (pH 7,4). Portanto, o presente trabalho visou desenvolver, caracterizar e avaliar lipossomas contendo TMZ funcionalizados com transferrina (Tf) para a entrega ao cérebro via administração intranasal objetivando maior disponibilidade cerebral da TMZ. Os lipossomas (LIP) foram obtidos via hidratação do filme lipídico, seguido de extrusão para posterior conjugação com Tf. Os lipossomas foram funcionalizados via processos distintos, maleímida e carbodiimida, sendo que em ambos os processos os lipossomas mostraram-se monodispersos (PDI<0,2) de tamanho reduzido (< 200 nm) e carga superficial negativa e positiva, respectivamente. A análise de eficiência de conjugação e da integridade da proteína mostraram que o processo de conjugação via maleímida mantém a proteína mais estável comparado ao processo via carbodiimida, sendo, portanto, o método escolhido. A inserção do fármaco não alterou as propriedades coloidais das formulações LIP e LIP TF, obtida via maleímida, com os dados de rastreamento de partícula confirmando a homogeneidade e o tamanho da amostra, que se mostraram estáveis por 90 dias e biocompatíveis quando avaliados via HET-CAM. A formulação LIP TMZ apresentou maior eficiência de encapsulação (68,45 ± 9,48) comparada aos LIP TMZ TF (37,95±4,17), porém ambos os lipossomas apresentaram propriedade de liberação controla com perfis semelhantes em pH 6,4 e 5,1, indicando a capacidade em conter o fármaco durante a administração nasal e na presença de compartimentos celulares ácidos. A interação com proteínas do soro demonstrou a estabilidade do sistema frente a meios biologicamente relevantes, à medida que a atividade sob esferoides de GBM em 72 h dos LIP TMZ TF ─ viabilidade de ~40%, demonstrou o potencial biológico desses nanosistemas. A incorporação dos lipossomas nos hidrogéis de poloxâmer e goma gelana (20:0,01%, m/v) através da gelificação direta foi observada pela mudança da rugosidade superficial dos hidrogéis analisada por MEV e mudanças na entalpia do sistema por DSC. Os resultados de análise de regime estacionário e oscilatório demonstram que a incorporação dos lipossomas não alterou a resposta à temperatura do poloxâmer, ao passo que as análises de textura e mucoadesão na presença de fluido nasal evidenciam que a concentração de goma gelana ocasiona uma resposta ao nível micro-estrutural da matriz, aumentando sua coesão e adesividade. Considerando a agressividade do GBM e a limitada opção terapêutica os resultados sugerem que o sistema ou os lipossomas individualizados possuem potencial para aumentar a interação com células tumorais reduzindo a perda sistêmica devido à via proposta, contribuindo para o desenho experimental de estudos futuros envolvendo plataformas de administração nasal para entrega de sistema lipossomais ao cérebro.

Glioblastoma (GBM) is a highly aggressive diffuse solid brain tumor. Temozolomide (TMZ), the only drug available for treatment, is not very effective due to its poor distribution in the brain, as it is a prodrug that hydrolyzes to the methyl diazonium cation — the active metabolite — at physiological pH (pH 7.4). Therefore, the present study aimed to develop, characterize, and evaluate TMZ-containing liposomes functionalized with transferrin (Tf) for delivery to the brain via intranasal administration, with the goal of increasing the cerebral availability of TMZ. The liposomes (LIP) were prepared by hydration of a lipid film, followed by extrusion and subsequent conjugation with Tf. The liposomes were functionalized using two distinct processes—maleimide and carbodiimide—and in both processes, the liposomes were found to be monodisperse (PDI < 0.2) with small sizes (< 200 nm) and negative and positive surface charges, respectively. Analysis of conjugation efficiency and protein integrity showed that the maleimide-mediated conjugation process maintains greater protein stability compared to the carbodiimide-mediated process; therefore, the maleimide method was selected. The incorporation of the drug did not alter the colloidal properties of the LIP and LIP TF formulations, prepared via maleimide, with particle tracking data confirming the homogeneity and size of the sample, which remained stable for 90 days and were biocompatible when evaluated via HET-CAM. The LIP TMZ formulation exhibited higher encapsulation efficiency (68.45 ± 9.48) compared to LIP TMZ TF (37.95 ± 4.17), however, both liposomes exhibited controlled-release properties with similar profiles at pH 6.4 and 5.1, indicating their ability to retain the drug during nasal administration and in the presence of acidic cellular compartments. Interaction with serum proteins demonstrated the system’s stability in biologically relevant environments, as the activity of LIP TMZ TF on GBM spheroids at 72 hour with a viability of ~40%— demonstrated the biological potential of these nanosystems. The incorporation of liposomes into poloxamer and gellan gum hydrogels (20:0.01%, w/v) via direct gelation was observed through changes in the surface roughness of the hydrogels, as analyzed by SEM, and changes in the system’s enthalpy, as measured by DSC. The results of steady-state and oscillatory regime analyses demonstrate that the incorporation of liposomes did not alter the temperature response of poloxamer, whereas texture and mucoadhesion analyses in the presence of nasal fluid show that the concentration of gellan gum induces a response at the microstructural level of the matrix, increasing its cohesion and adhesiveness Given the aggressiveness of GBM and the limited treatment options, the results suggest that the system or the individualized liposomes have the potential to increase interaction with tumor cells while reducing systemic loss due to the proposed route, thereby contributing to the experimental design of future studies involving nasal administration platforms for delivering liposomal systems to the brain.