Biophysicochemical evaluation of drugs incorporated into hyaluronic acid hydrogels for pain control and regulation of the inflammatory process in temporomandibular dysfunction

Temporomandibular disorder (TMD) is a public health problem that affects 12% of the world’s population. Its clinical presentation is diverse and may include myalgia, arthralgia, headache, malocclusion, clicking, crepitus, and reduced mouth opening, among other signs and symptoms. The pathophysiology of the condition is attributed to immuno-inflammatory dysregulation; therefore, treatments are based on regulating this process. Thus, in the search for an effective therapeutic option, this study aimed to develop and evaluate the biophysicochemical properties of hydrogels based on hyaluronic acid conjugated with bupivacaine, ketoprofen, or hydrocortisone for pain control and regulation of the inflammatory process in temporomandibular dysfunction. For the physicochemical analyses, field emission scanning electron microscopy (FEG-SEM), Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), thermogravimetry, and oscillatory rheology testing were performed. Biological assays were performed on mouse macrophages (RAW 264.7) to evaluate the cytocompatibility of the biomaterials using the alamar blue colorimetric assay, in accordance with OECD 129; in addition, genotoxicity was assessed using the micronucleus assay in accordance with OECD 487. Data with a normal distribution were analyzed using ANOVA supplemented by Tukey’s test, with a significance level of 5% (p ≤ 0.05); data that did not follow a normal distribution were analyzed using the Kruskal-Wallis test supplemented by Dunn’s test, with a significance level of 5% (p ≤ 0.05). As a result, physicochemical analysis by FTIR spectroscopy identified the characteristic bands of hyaluronic acid (HA), bupivacaine (BUP), ketoprofen (CET), and hydrocortisone (HID), with no significant chemical interactions between the drugs and the polymer. Morphological analysis by SEM-FEG revealed a porous, three-dimensional structure in all hydrogels, with no evident structural changes due to the incorporation of the drugs. Thermogravimetric analysis indicated that the combination with HA increased the thermal stability of the drugs, resulting in more gradual mass losses. Rheological analysis confirmed stable viscoelastic behavior (G' > G'‘), with autoclaving increasing the stiffness of pure AH, while the addition of drugs generally reduced the storage modulus (G’). Regarding biocompatibility, the conjugated hydrogels maintained or increased cell viability in RAW 264.7 macrophages, in contrast to the cytotoxic observed for the individual drugs at high concentrations. In the genotoxicity assessment, the bupivacaine and ketoprofen hydrogels did not exhibit genotoxic effects, whereas the hydrocortisone hydrogel induced micronuclei at concentrations of 0.5 and 1 mg, in proportion to the increase in drug concentration. In conclusion, hyaluronic acid hydrogels combined with bupivacaine, ketoprofen, and hydrocortisone exhibited viscoelastic properties and thermal stability suitable for the temporomandibular joint, in addition to demonstrating cytocompatibility and the absence of genotoxicity in in vitro tests.

Resumo (francês)

Les troubles temporo-mandibulaires (TTM) constituent un problème de santé publique touchant 12 % de la population mondiale. Leur présentation clinique est variée et peut inclure, entre autres signes et symptômes, des myalgies, des arthralgies, des céphalées, une malocclusion, des clics articulaires, des crépitements et une réduction de l'ouverture buccale. La physiopathologie de la maladie s'explique par une dérégulation immuno-inflammatoire ; par conséquent, les traitements visent à réguler ce processus. Ainsi, dans la recherche d'une option thérapeutique efficace, cette étude a visé à développer et à réaliser une évaluation biophysicochimique d'hydrogels à base d'acide hyaluronique conjugués à la bupivacaïne, au kétoprofène ou à l'hydrocortisone, pour le contrôle de la douleur et la régulation du processus inflammatoire lié aux TTM. Les analyses physico-chimiques ont inclus la microscopie électronique à balayage à émission de champ (FE-SEM), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier avec réflexion totale atténuée (FTIR-ATR), la thermogravimétrie et des essais de rhéologie oscillatoire. Des analyses biologiques ont été effectuées sur des macrophages de souris (RAW 264.7) afin d'évaluer la cytocompatibilité des biomatériaux à l'aide du test colorimétrique Alamar Blue, conformément à la ligne directrice 129 de l'OCDE. La génotoxicité a été évaluée par le test des micronoyaux selon la ligne directrice 487 de l'OCDE. Les données suivant une distribution normale ont été analysées par ANOVA suivie du test de Tukey (seuil de signification p ≤ 0,05), tandis que les données ne suivant pas une distribution normale ont été analysées par le test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn (seuil de signification p ≤ 0,05). L'analyse physico-chimique par spectroscopie FTIR-ATR a permis d'identifier les bandes caractéristiques de l'acide hyaluronique (HA), de la bupivacaïne (BUP), du kétoprofène (CET) et de l'hydrocortisone (HID), sans qu'aucune interaction chimique significative ne soit observée entre les médicaments et le polymère. L'analyse morphologique par microscopie électronique à balayage à émission de champ (FEG-SEM) a révélé une structure poreuse tridimensionnelle dans tous les hydrogels, sans modification structurelle apparente liée à l'incorporation des médicaments. L'analyse thermogravimétrique a indiqué que l'association avec l'acide hyaluronique (AH) augmentait la stabilité thermique des médicaments, entraînant une perte de masse plus progressive. L'analyse rhéologique a confirmé un comportement viscoélastique stable (G' > G'') ; l'autoclavage a accru la rigidité de l'AH pur, tandis que l'ajout de médicaments a généralement réduit le module de conservation (G'). En termes de biocompatibilité, les hydrogels chargés en médicaments ont maintenu ou augmenté la viabilité cellulaire des macrophages RAW 264.7, contrastant avec la cytotoxicité observée pour les médicaments seuls à fortes concentrations. Lors de l'évaluation de la génotoxicité, les hydrogels à la bupivacaïne et au kétoprofène n'ont présenté aucun effet génotoxique ; en revanche, l'hydrogel contenant de l'hydrocortisone a induit la formation de micronoyaux aux concentrations de 0,5 et 1 mg, de manière proportionnelle à l'augmentation de la concentration en médicament. En conclusion, les hydrogels d'acide hyaluronique combinés à la bupivacaïne, au kétoprofène et à l'hydrocortisone ont présenté des propriétés viscoélastiques et une stabilité thermique adaptées à l'articulation temporo-mandibulaire, tout en démontrant une cytocompatibilité et une absence de génotoxicité lors des tests in vitro.

Resumo (português)

A disfunção temporomandibular (DTM) é um problema de saúde publica que afeta 12% da população mundial. Sua apresentação clínica é diversa, podendo ser composta de mialgia, artralgia, cefaleia, má oclusão, estalidos, crepitações, redução da abertura de boca, entre outros sinais e sintomas. A fisiopatologia da doença é explicada pela desregulação imuno-inflamatória, portanto os tratamentos são baseados na regulação desse processo. Assim, na busca por uma opção terapêutica eficaz, o presente trabalho visou o desenvolvimento e avaliação biofísicoquímica de hidrogéis a base de ácido hialurônico conjugado a bupvacaína; cetoprofeno ou hidrocortisona para controle da dor e regulação do processo inflamatório na disfunção temporomandibular. Para as análises físico-químicas foram realizados a microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo (MEV-FEG), espectroscopia infravermelho por transformada de Fourier com reflectância total atenuada (FTIR-ATR), termogravitometria e ensaio de reologia em regime oscilatório. As análises biológicas foram realizadas sobre macrófagos de camundongos (RAW 264.7) avaliando a citotocompatibilidade dos biomateriais por meio do teste colorimétrico azul de alamar, conforme a OECD 129; Além da avaliação da genotoxicidade por micronúcleos seguindo a OECD 487. Dados com distribuição normal foram avaliados pelo método ANOVA complementado pelo Teste de Tukey, com nível de significância de 5% (p≤0.05); já os que não obtiveram distribuição normal foram analisados por Kruskal Wallis suplementado por Dunn’s com nível de significância de 5% (p≤0.05). Como resultado, a análise físico-química por espectroscopia FTIR-ATR, identificou as bandas características do ácido hialurônico (AH), bupivacaína (BUP), cetoprofeno (CET) ou hidrocortisona (HID), sem interações químicas significativas entre os fármacos e o polímero. A análise morfológica por MEV-FEG revelou uma estrutura porosa e tridimensional em todos os hidrogéis, sem alterações estruturais evidentes pela incorporação dos fármacos. A termogravimetria indicou que a associação com o AH aumentou a estabilidade térmica dos fármacos, com perdas de massa mais graduais. A análise reológica confirmou um comportamento viscoelástico estável (G' > G''), com a autoclavagem aumentando a rigidez do AH puro, enquanto a adição de fármacos geralmente reduziu o módulo de armazenamento (G'). Quanto à biocompatibilidade, os hidrogéis conjugados mantiveram ou aumentaram a viabilidade celular em macrófagos RAW 264.7, contrastando com a citotoxicidade observada para os fármacos isolados em altas concentrações. Na avaliação de genotoxicidade os hidrogéis de Bupivacaína e Cetoprofeno não apresentaram efeitos genotóxicos, já o hidrogel com Hidrocortisona exibiu indução de micronúcleos, nas concentrações de 0,5 e 1 mg, proporcional ao aumento da concentração do fármaco. Em conclusão, os hidrogéis de ácido hialurônico associado a bupvacaína, cetoprofeno e hidrocortisona apresentaram propriedades viscoelasticas e termoestabilidade adequadas a articulação temporomandibular, além de exibirem citocompatibilidade e ausência de genotoxicidade nos testes in vitro.