Engenharia metabólica sistemática de Bacillus subtilis para produção de surfactina

Abstract

A surfactina atrai grande interesse industrial por ser o biossurfactante mais potente conhecido. Comparada aos surfactantes de origem sintética, ela apresenta vantagens como menor toxicidade, alta biodegradabilidade, maior capacidade de produção de espuma e menor impacto ambiental. Entretanto, o custo de produção associado à baixa produtividade das linhagens selvagens de Bacillus dificultam a implementação industrial do bioprocesso. Os avanços recentes em técnicas de edição gênica, engenharia metabólica e biologia sintética incorporados à abordagem proposta neste trabalho permitem novo fôlego à perspectiva de tornar a produção de surfactina um bioprocesso industrialmente viável. Neste trabalho, utilizamos a ferramenta de edição gênica CRISPR-Cas9 para engenharia metabólica sistemática da linhagem de B. subtilis KS01, a qual apresenta características interessantes para a aplicação industrial: crescimento robusto e rápido, fácil manipulação genética, versatilidade para crescimento em diferentes meios de cultura e fontes de carbono. Construímos 14 novas linhagens combinando oito diferentes edições gênicas, em que manipulamos a expressão de genes envolvidos tanto na via de biossíntese de surfactina quanto nas vias de biossíntese de precursores, além de eliminarmos vias competitivas. As nossas duas principais linhagens, KS06 e KS10, produzem 2,5 e 2,6 g/L de surfactina em meio complexo PW em frascos agitados, e apresentam o rendimento de produto por biomassa YP/X de 0,85 e 0,9 g/g, respectivamente. A linhagem KS06 se destacou pelo crescimento rápido e pela redução significativa de 7% na perda de carbono pelas vias fermentativas, produzindo cerca de 26% menos acetato que a linhagem parental KS01. Já a linhagem KS10 apresentou perfil de crescimento moderado, reduziu em 8% o direcionamento de carbono para as vias fermentativas e se destacou por produzir majoritariamente (63%) as isoformas C14 ou menores de surfactina. Finalizamos este projeto com duas linhagens principais, KS06 e KS10, com diferentes características que podem ser vantajosas dependendo da aplicação final da surfactina produzida.

Surfactin attracts significant industrial interest as the most potent biosurfactant known. Compared to synthetic surfactants, surfactin offers advantages such as lower toxicity, high biodegradability, greater foam production capacity, and a lower environmental impact. However, the production cost associated with the low productivity of wild-type Bacillus strains hinders the industrial implementation of the bioprocess. Recent advances in gene editing, metabolic engineering, and synthetic biology techniques, incorporated into the approach proposed in this work, provide a new stimulus for the prospect of making surfactin production an industrially viable bioprocess. In this work, we used the CRISPR-Cas9 gene editing tool for systematic metabolic engineering of the B. subtilis KS01 strain, which exhibits interesting characteristics for industrial applications, including robust and rapid growth, ease of genetic manipulation, and versatility for growth across different culture media and carbon sources. We engineered 14 new strains by combining eight different gene editions, manipulating the expression of genes involved in both the surfactin biosynthesis pathway and precursor biosynthesis pathways, while also eliminating competing pathways. Our two leading strains, KS06 and KS10, produce 2.5 and 2.6 g/L of surfactin in PW complex medium in shake flasks, with product yields per biomass YP/X of 0.85 and 0.9 g/g, respectively. Strain KS06 stood out for its rapid growth and significant 7% reduction in carbon loss through fermentative pathways, producing approximately 26% less acetate than the parental strain KS01. Strain KS10, on the other hand, exhibited a moderate growth profile, hindering carbon allocation to fermentative pathways by 8%, and stood out for producing primarily (63%) C14 isoform of surfactin. We concluded this project with two main strains, KS06 and KS10, with different characteristics that may be advantageous depending on the final application of the surfactin produced.