Validação das proteínas de vesículas extracelulares H2A e CSTA como potenciais biomarcadores para o câncer de mama triplo-negativo

Abstract

O câncer de mama triplo-negativo (CMTN) é considerado um dos subtipos mais agressivos de câncer de mama (CM), caracterizado pela ausência de expressão dos receptores de estrogênio (RE), de progesterona (RP) e do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2). Essa característica limita as opções terapêuticas e contribui para um prognóstico menos favorável, além de dificultar a identificação precoce da doença por meio de biomarcadores específicos. Nesse contexto, a busca de novos marcadores moleculares capazes de auxiliar no diagnóstico e no acompanhamento clínico do CMTN torna-se essencial. A biópsia líquida, que consiste na análise de fluidos biológicos para a detecção de moléculas, constitui uma abordagem promissora por ser um método de caráter minimamente invasivo e permitir o monitoramento dinâmico da doença. Entre os componentes detectáveis, destacam-se as vesículas extracelulares (VEs), estruturas que carregam proteínas, lipídios e ácidos nucleicos representativos de sua célula de origem e que têm sido investigadas como fontes de biomarcadores em diferentes tipos de câncer. Entre as proteínas identificadas em VEs, a histona H2A (H2A) e a cistatina A (CSTA) despertam interesse por sua possível associação com processos relacionados à tumorigênese. A H2A participa da organização da cromatina e da regulação da expressão gênica, podendo refletir alterações epigenéticas presentes em células tumorais. Já a CSTA atua como inibidora de proteases cisteínicas, participando de processos ligados à remodelação tecidual, invasão celular e progressão tumoral. Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar a expressão das proteínas H2A e CSTA em VEs isoladas do plasma de pacientes e em amostras de tecido tumoral mamário, investigando seu potencial como biomarcadores para o CMTN. Foram coletadas amostras de 159 pacientes entre outubro de 2024 e julho de 2025 e, ao final, 150 foram elegíveis: 12 controles, 85 com lesões benignas e 53 com tumores malignos (15 Luminal A, 19 Luminal B, 6 HER2+ e 13 CMTN). As amostras foram organizadas em 21 pools. As VEs foram analisadas por meio de ensaio imunoenzimático (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), e os tecidos tumorais foram avaliados por imuno-histoquímica. A quantificação por ELISA revelou diferenças estatisticamente significativas para ambas as proteínas, sendo a CSTA mais expressa no grupo Triplo-negativo em relação aos grupos Luminal A (p = 0,0055) e Benigno (p = 0,0022), e a H2A maior em relação aos grupos Luminal B (p = 0,0186), Benigno (p = 0,0018) e Controle (p = 0,0280). Na análise imuno-histoquímica, a CSTA apresentou maior expressão no grupo Triplo-negativo em comparação a todos os demais grupos (p < 0,0001). A H2A apresentou maior expressão em relação aos grupos Luminal A (p = 0,0484) e Benigno (p = 0,0046), com predomínio de marcação nuclear e citoplasmática maior em comparação ao grupo Luminal B (p = 0,0203). Em conjunto, os resultados indicam que as proteínas CSTA e H2A apresentam padrões de expressão associados ao CMTN, sugerindo potencial como candidatas a biomarcadores, embora estudos adicionais sejam necessários para confirmar o potencial diagnóstico e a aplicabilidade como biomarcadores.

Triple-negative breast cancer (TNBC) is considered one of the most aggressive subtypes of breast cancer (BC), characterized by the absence of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) expression. These characteristics limit treatment options and contribute to a less favorable prognosis, in addition to hindering the early identification of the disease through specific biomarkers. In this context, the search for new molecular markers capable of aiding in the diagnosis and clinical monitoring of TNBC becomes essential. Liquid biopsy, which involves the analysis of biological fluids to detect molecules, is a promising approach because it is a minimally invasive method that allows for dynamic monitoring of the disease. Among the detectable components, extracellular vesicles (EVs) stand out; these are structures that carry proteins, lipids, and nucleic acids representative of their cell of origin and have been investigated as sources of biomarkers in different types of cancer. Among the proteins identified in EVs, histone H2A (H2A) and cystatin A (CSTA) are of particular interest due to their potential association with processes related to tumorigenesis. H2A plays a role in chromatin organization and gene expression regulation and may reflect epigenetic alterations present in tumor cells. CSTA, on the other hand, acts as a cysteine protease inhibitor, playing a role in processes related to tissue remodeling, cellular invasion, and tumor progression. Given this, the present study aimed to evaluate the expression of the H2A and CSTA proteins in VE cells isolated from patient plasma and in breast tumor tissue samples, investigating their potential as biomarkers for TNBC. Samples were collected from 159 patients between October 2024 and July 2025, and ultimately, 150 were eligible: 12 controls, 85 with benign lesions, and 53 with malignant tumors (15 Luminal A, 19 Luminal B, 6 HER2+, and 13 TNBC). The samples were organized into 21 pools. The EVs were analyzed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and the tumor tissues were evaluated by immunohistochemistry. ELISA quantification revealed statistically significant differences for both proteins, with CSTA being more highly expressed in the triple-negative group compared to the Luminal A (p = 0.0055) and Benign (p = 0.0022) groups, and H2A was higher compared to the Luminal B (p = 0.0186), Benign (p = 0.0018), and Control (p = 0.0280) groups. In the immunohistochemical analysis, CSTA showed higher expression in the Triple-negative group compared to all other groups (p < 0.0001). H2A showed higher expression compared to the Luminal A (p = 0.0484) and Benign (p = 0.0046) groups, with a predominance of nuclear and cytoplasmic staining that was greater than in the Luminal B group (p = 0.0203). Taken together, the results indicate that the CSTA and H2A proteins exhibit expression patterns associated with TNBC, suggesting their potential as biomarker candidates; however, further studies are needed to confirm their diagnostic potential and applicability as biomarkers.