Desenvolvimento e validação de modelo de Tecido Pulmonar Humano (3D) para estudo da interação patógeno-hospedeiro de biofilme de Histoplasma capsulatum

Abstract

A histoplasmose, uma Infecção Fúngica Invasiva (IFI), é ocasionada pelo fungo termodimórfico Histoplasma capsulatum que possui ampla distribuição mundial. Trata-se da quarta IFI com maior número de casos anuais, atingindo mais de 600 mil pessoas todos os anos. Nas duas últimas décadas as IFIs têm aumentado no mundo inteiro e o número de pacientes em risco tem crescido drasticamente. Recentemente, foi estabelecida uma correlação entre o modo de infecção de H. capsulatum e a formação de biofilmes, caracterizados por serem aglomerados celulares complexos, onde há produção de uma matriz extracelular que por si só confere proteção ao ambiente externo, que induzem, entre outros, a resistência antifúngica. A interação patógeno-hospedeiro de biofilmes de H. capsulatum é essencial para o estabelecimento da doença e necessita de estudos com modelos in vitro fidedignos ao observado em humanos. Dessa maneira, esse projeto de pesquisa tem como objetivo desenvolver e a validar um modelo tridimensional de tecido pulmonar humano para estudo da interação patógeno-hospedeiro de biofilme de H. capsulatum, para futuramente caracterizar os mecanismos de virulência envolvidos na infecção. Para isso, desenvolveu-se um tecido pulmonar humano funcional composto pelo tri-cultivo de células Calu-3 (epiteliais de traqueia de pulmão humano) diferenciadas por Air-Liquid Interface (IAL), células MRC-5 (fibroblastos de pulmão humano) e THP-1 (monócitos humanos) diferenciados em macrófago-like para a construção de tecido estratificado in vitro. A validação do modelo tridimensional foi realizada por Microscopia Multiparamétrica Multifóton (MMM) para visualização da expansão celular ao longo do tempo de desenvolvimento do modelo, Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e a análise da diferenciação das células Calu-3 por RT-qPCR de genes característicos de cada subtipo celular (KRT5, TP63, MUC5AC, SCGB1A1, FOXJ1). Além disso, foi realizada a padronização da infecção do modelo por biofilmes de H. capsulatum através da quantificação da expressão de genes diferencialmente expressos já caracterizados pelo nosso grupo tanto do fungo (Hsp60, CatB, DDR48, GAPDH e CBP1) quanto das células hospedeiras (C3AR1, GNB2, PDCL, ITHB2, FERMT3, ACTB e NCKAP1L).

Histoplasmosis, an invasive fungal infection (IFI), is caused by the thermally dimorphic fungus Histoplasma capsulatum, which has a wide global distribution. It is the fourth most prevalent IFI in terms of annual cases, affecting more than 600,000 individuals worldwide each year. Over the past two decades, the incidence of IFIs has increased globally, accompanied by a drastic rise in the number of individuals at risk. Recently, a correlation has been established between the mode of H. capsulatum infection and biofilm formation. Biofilms are characterized as complex cellular aggregates in which the production of an extracellular matrix provides protection against the external environment and contributes, among other factors, to antifungal resistance. The pathogen–host interaction mediated by H. capsulatum biofilms is essential for disease establishment and requires studies using in vitro models that faithfully reproduce human conditions. Therefore, this research project aimed to develop and validate a three-dimensional human lung tissue model to investigate the pathogen–host interaction of H. capsulatum biofilms, with the future goal of characterizing the virulence mechanisms involved in infection. To this end, a functional human lung tissue was developed, consisting of a tri-culture of Calu-3 cells (human tracheal epithelial cells) differentiated under Air–Liquid Interface (ALI) conditions, MRC-5 cells (human lung fibroblasts), and THP-1 cells (human monocytes) differentiated into macrophage-like cells, enabling the construction of a stratified in vitro tissue. The validation of the threedimensional model was performed using multiparametric multiphoton microscopy (MMM) to visualize cellular expansion throughout model development, transmission electron microscopy (TEM), and RT-qPCR analysis to assess the differentiation of Calu-3 cells through the expression of genes characteristic of each epithelial cell subtype (KRT5, TP63, MUC5AC, SCGB1A1, and FOXJ1). In addition, infection of the model with H. capsulatum biofilms was standardized by quantifying the expression of differentially expressed genes previously characterized by our group, including fungal genes (Hsp60, CatB, DDR48, GAPDH, and CBP1) as well as host cell genes (C3AR1, GNB2, PDCL, ITHB2, FERMT3, ACTB, and NCKAP1L).