Avaliação do efeito sinérgico entre o peptídeo 0WHistatina-5 e antifúngicos comerciais na inibição do crescimento de Candida albicans

Abstract

Candida albicans é uma espécie que geralmente se apresenta como um fungo comensal presente na microbiota humana, que pode se desenvolver como patógeno oportunista e causar infecções, principalmente em pacientes imunodeprimidos. Frente ao surgimento de resistência a antifúngicos a busca por novas alternativas terapêuticas se torna necessária. Nesse contexto, os peptídeos antimicrobianos, como a Histatina-5 presente na saliva, se mostram como potenciais candidatos para o combate de infecções fúngicas. Além disso, as terapias combinatórias se demonstram uma opção valiosa no tratamento dessas infecções, principalmente daquelas causadas por cepas resistentes. O objetivo desse trabalho foi avaliar a ocorrência de sinergismo pela combinação do peptídeo 0WHistatina-5 (0WHst5) e os fármacos fluconazol (Flu) e nistatina (Nys) na inibição do crescimento de C. albicans. O peptídeo foi obtido pela síntese de peptídeos em fase sólida, purificado por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizado por espectrometria de massas. A concentração inibitória mínima (CIM) do peptídeo e dos fármacos para as cepas C. albicans ATCC 90028, C. albicans ATCC 18804 e C. albicans ATCC 10231 foi determinada pelo método da microdiluição em caldo. O ensaio checkerboard foi utilizado para avaliar a inibição do crescimento de C. albicans ATCC 90028 pela combinação de diferentes concentrações de 0WHst5 e dos fármacos. Por fim, realizou-se o ensaio time-kill, a fim de observar o perfil temporal de ação das combinações e determinar qual combinação possuía maior potencial terapêutico. O processo de síntese e purificação foi bem-sucedido e a espectrometria de massas confirmou a identidade do peptídeo. A CIM do peptídeo foi de 80 μmol L-1 para as três cepas testadas; para Nys, a CIM foi 2,2 μmol L-1 para C. albicans ATCC 18804 e 4,3 μmol L-1 para as demais; para Flu, a CIM foi 13 μmol L-1 para a cepa C. albicans ATCC 90028 e >400 μmol L-1 para as demais. Os dados do ensaio checkerboard foram analisados na plataforma SynergyFinder e foi observado um valor indicativo de sinergismo para a combinação 0WHst5/Flu por todos os modelos aplicados, enquanto para a combinação 0WHst5/Nys se obteve um valor indicativo de aditividade ou antagonismo a depender do modelo aplicado. O ensaio time-kill permitiu a visualização dos efeitos de inibição de algumas das combinações e principalmente uma comparação com a ação individual do peptídeo e dos fármacos. Para as três cepas testadas observou-se uma diferença bastante significativa entre a ação individual do Flu e a ação da combinação 0WHst5/Flu, tanto ao final, quanto ao longo do ensaio. Para a combinação com Nys também observou-se melhores perfis temporais para a associação, porém as mudanças em relação ao perfil individual foram menos acentuadas, o que já era esperado pelos resultados obtidos no ensaio checkerboard. Desta forma, este trabalho mostrou que a associação do peptídeo 0WHistatina-5 a fármacos convencionais pode representar uma alternativa para o combate e inibição de infecções causada por C. albicans.

Candida albicans is a species that is usually a commensal fungus present in the human microbiota, which can develop as an opportunistic pathogen and cause infections, especially in immunocompromised patients. Taking into account the emergence of resistance to antifungals, such as fluconazole, the search for new therapeutic alternatives is necessary. In this context, antimicrobial peptides, such as Histatin-5 from human saliva, become potential candidates for combating fungal infections. In addition, combinatorial therapies are aslo a valuable option in the treatment of these infections, especially those caused by resistant strains. The aim of this work was to evaluate the occurrence of synergism by combination of the peptide 0WHistatin-5 (0WHst5) and the drugs fluconazole (Flu) and nystatin (Nys) to inhibit the growth of C. albicans. The peptide was obtained by solid phase peptide synthesis, purified by high performance liquid chromatography and characterized by mass spectrometry. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the peptide and drugs for the strains C. albicans ATCC 90028, C. albicans ATCC 18804 and C. albicans ATCC 10231 was determined by broth microdilution method. The checkerboard assay was used to assess the inhibition of C. albicans ATCC 90028 growth by combining different concentrations of 0WHst5 and the drugs. Finally, the time-kill assay was carried out in order to observe the action of the combinations timewise and determine which combination had the greatest therapeutic potential. The synthesis and purification processes were successful and mass spectrometry confirmed the identity of the peptide. The MIC of the peptide was 80 μmol L-1 for the three tested strains; for Nys, the MIC was 2,2 μmol L-1 for C. albicans ATCC 18804 and 4,3 μmol L-1 for the other two; for Flu, the MIC was 13 μmol L-1 for the strain C. albicans ATCC 90028 and >400 μmol L-1 for the other two. Data from checkerboard assay were analyzed using SynergyFinder platform and synergism was suggested for the 0WHst5/Flu combination for all applied models, while for the 0WHst5/Nys combination an the values suggested additivity or antagonism depending on the model applied. The time-kill assay allowed a better visualization of the inhibition effects of some of the combinations and a comparison with the individual action of the peptide and the drugs. For the three strains tested, a very significant difference was observed between the individual action of Flu and the action of the 0WHst5/Flu combination. For combination with Nys, better time profiles were also observed for the association, but the changes in comparison to the individual profile were smaller than the ones observed for Flu, which was already expected due to the results obtained in the checkerboard assay. Thus, this work showed that the association of the peptide 0WHistatina-5 with conventional drugs may have potential as an alternative to combat and inhibit infections caused by C. albicans.