Análise lipídica de espermatozoides de garanhões resistentes e sensíveis a criopreservação

Abstract

O perfil lipídico da membrana espermática está relacionado com a qualidade espermática do sêmen pós-descongelação. A criopreservação do sêmen é uma das biotécnicas mais utilizadas, mas promove uma diminuição na qualidade espermática pós-descongelação, e em alguns animais essa diminuição é mais acentuada, sendo estes considerados maus congeladores (BAD Freezers). A permeabilidade da membrana espermática é influenciada pela sua composição lipídica. Identificar e entender como o perfil lipídico do espermatozoide interfere na qualidade espermática, e entender suas interações é uma ferramenta importante para melhorar a qualidade do sêmen criopreservado. O presente estudo teve como objetivo analisar e identificar os lipídios do espermatozoide correlacionados a crio-tolerância em garanhões criossensíveis (BAD Freezer) e criorresistentes (GOOD Freezer). Foram utilizados 16 animais (n=16), sendo: 8 BAD Freezer e 8 GOOD Freezer. Para obter o perfil lipídico das matrizes amostrais distintas dos espermatozoides purificados, após a remoção do plasma seminal foi realizado MALDI-MS. Os dados gerados foram processados no MetaboAnalyst 6.0 aplicando-se a análise discriminante de mínimos quadrados parciais (PLS-DA) para avaliar a separação dos perfis entre os grupos BAD e GOOD. Os lipídios que apresentaram expressão diferencial foram identificados por meio do teste-t, e o gráfico Volcano foi utilizado para comparar os grupos, utilizando os seguintes critérios: valores de P<0,05 e fold-change (FC) ≥ 2. Para validar a relevância estatística, calculou-se a Importância da Variável na Projeção (VIP) do modelo PLS-DA, assim foram selecionados apenas os lipídios que se apresentaram em comum no gráfico Volcano e VIP, e então realizada a identificação e avaliação do perfil lipídio. O rastreamento lipidômico por MALDI-MS identificou um total de 165 lipídios nos espermatozoides. Desses, 10 mostraram diferenças significativas entre os grupos, 4 em maior abundância nos BAD (960.5094 [IPC 38:0;O3], 517.2585 [ST 29:3;O], 924.4688 [PC 39:7 / PE 42:7], e 424.1616 [CAR 10:0]), e 6 apresentaram maior abundância nos GOOD (623.3115 [LPI 18:0], 804.4195 [PS 35:6], 873.4483 [PI 34:5], 510.255 [LPC 14:1 / LPE 17:1], 782.4298 [PC O-29:1 / PE O-32:1], 427.2135 [ST 23:4;O6]). Em conclusão, o perfil lipídico apresenta características de separação dos grupos, e possibilita a identificação de biomarcadores associados a criorresistência espermática pós-descongelação. Foi possível ainda identificar a participação dos lipídios em diversos metabolismos.

The lipid profile of the sperm membrane is related to the sperm quality of semen after thawing. Semen cryopreservation is one of the most widely used biotechniques, but it promotes a decrease in post-thawing sperm quality, and in some animals this decrease is more pronounced, these being considered poor freezers (BAD Freezers). The permeability of the sperm membrane is influenced by its lipid composition. Identifying and understanding how the sperm lipid profile interferes with sperm quality, and understanding their interactions, is an important tool to improve the quality of cryopreserved semen. The present study aimed to analyze and identify sperm lipids correlated with cryo-tolerance in cryosensitive (BAD Freezer) and cryoresistant (GOOD Freezer) stallions. Sixteen animals (n=16) were used: 8 BAD Freezer and 8 GOOD Freezer. To obtain the lipid profile of the distinct sample matrices of purified spermatozoa, MALDI-MS was performed after seminal plasma removal. The generated data were processed in MetaboAnalyst 6.0, applying partial least squares discriminant analysis (PLS-DA) to evaluate the separation of profiles between the BAD and GOOD groups. Lipids showing differential expression were identified using the t-test, and the Volcano plot was used to compare the groups, using the following criteria: P-values <0.05 and fold-change (FC) ≥ 2. To validate statistical relevance, the Importance of the Variable in Projection (VIP) of the PLS-DA model was calculated; thus, only the lipids that were common in the Volcano and VIP plots were selected, and then the identification and evaluation of the lipid profile were performed. Lipidomic screening by MALDI-MS identified a total of 165 lipids in the spermatozoa. Of these, 10 showed significant differences between the groups, 4 with greater abundance in BAD (960.5094 [IPC 38:0;O3], 517.2585 [ST 29:3;O], 924.4688 [PC 39:7 / PE 42:7], and 424.1616 [CAR 10:0]), and 6 showed greater abundance in GOOD (623.3115 [LPI 18:0], 804.4195 [PS 35:6], 873.4483 [PI 34:5], 510.255 [LPC 14:1 / LPE 17:1], 782.4298 [PC O-29:1 / PE O-32:1], 427.2135 [ST 23:4;O6]). In conclusion, the lipid profile shows characteristics that separate the groups and allows the identification of biomarkers associated with post-thaw sperm cryoresistance. It was also possible to identify the participation of lipids in various metabolisms.