Angiotensina II modula a resposta induzida pela proteína Spike do SARS-CoV-2 na expressão de ECA2, AT1R e MASR e a resposta inflamatória em células musculares lisas brônquicas humanas

Abstract

O SARS-CoV-2 utiliza sua proteína Spike (Sp) para se ligar à enzima conversora de angiotensina 2 (ECA2), facilitando a entrada viral nas células e desencadeando respostas inflamatórias nas vias aéreas. A ECA2 integra o sistema renina-angiotensina (SRA), que regula o equilíbrio entre as vias pró-inflamatória (ACE/Ang II/AT1R) e anti-inflamatória (ECA2/Ang-(1–7)/MASR). As células musculares lisas brônquicas (BSMCs) desempenham papel fundamental tanto na homeostase quanto na inflamação das vias aéreas. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos antagonistas do receptor AT1, losartana (LOS), e do receptor MAS, A-779, sobre a expressão de componentes do SRA e sobre a produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1β e IL-8 em BSMCs expostas à proteína Sp ou à Ang II, e se a Ang II regula as respostas induzidas pela proteína Sp. As células foram submetidas a um protocolo experimental com diferentes concentrações de Sp (50, 100 ou 500 ng/mL) e Ang II (100 ng/mL), incluindo também grupos sensibilizados com Ang II por uma hora antes da estimulação com Sp. As análises foram realizadas após 3, 12 e 24 hs de estimulação. Para avaliar os efeitos moduladores dos receptores, realizou-se pré-tratamento com LOS e A-779 por 1h ou 2 hs antes da exposição a Sp e Ang II. Foram avaliadas a expressão gênica de ECA2, AT1R, MASR, IL-1β e IL-8 por RT-qPCR; os níveis proteicos de IL-1β e IL-8 por ELISA; a expressão proteica de ECA2 por imunofluorescência; e a viabilidade celular por ensaio de MTT. Os resultados demonstraram que tanto Sp quanto Ang II aumentaram a expressão de AT1R e MASR. O tratamento com LOS e A-779 evidenciou que a expressão desses componentes é mediada pelos receptores AT1R e MASR, sendo que a pré-sensibilização com Ang II modulou negativamente a indução desses receptores pela Sp. A expressão de ECA2 foi estimulada independentemente da ativação dos receptores, porém o bloqueio de MASR com A-779 potencializou esse efeito. Os níveis de proteína ECA2 foram aumentados pela Sp, possivelmente por via dependente do AT1R, enquanto Ang II influenciou a secreção da ECA2. Sp e Ang II, induziram a expressão e secreção de IL-1β e IL-8 nas BSMCs, com efeitos da Ang II mais evidentes após 12h. A LOS inibiu a produção das citocinas induzida por Sp, destacando o papel inflamatório da via Ang II/AT1R. Já o bloqueio de MASR com A-779 aumentou as citocinas nas primeiras horas, confirmando seu papel protetor. A pré-sensibilização com Ang II reduziu IL-1β e IL-8, modulando as respostas da Sp de forma tempo-dependente. Esses achados reforçam a participação ativa da via SRA na inflamação induzida por SARS-CoV-2 nas BSMCs das vias aéreas.

SARS-CoV-2 utilizes its Spike protein (Sp) to bind to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), facilitating viral entry into host cells and triggering inflammatory responses in the airways. ACE2 is a key component of the renin-angiotensin system (RAS), which regulates the balance between the pro-inflammatory (ACE/Ang II/AT1R) and anti-inflammatory (ACE2/Ang-(1–7)/MASR) pathways. Bronchial smooth muscle cells (BSMCs) play a crucial role in both airway homeostasis and inflammation. This study aimed to investigate the effects of antagonists of the AT1 receptor, losartan (LOS), and the MAS receptor, A-779, on the expression of RAS components and on the production of the pro-inflammatory cytokines IL-1β and IL-8 in BSMCs exposed to Sp or angiotensin II (Ang II). Cells were subjected to an experimental protocol involving different concentrations of Sp (50, 100, or 500 ng/mL) and Ang II (100 ng/mL), including groups pre-sensitized with Ang II one hour prior to Sp stimulation. Analyses were performed at 3, 12, and 24 hours post-stimulation. To assess the modulatory effects of receptor antagonism, pre-treatment with LOS and A-779 was conducted for 1 and 2 hours before stimulation with Sp and Ang II. Gene expression of ACE2, AT1R, MASR, IL-1β, and IL-8 was evaluated by RT-qPCR; protein levels of IL-1β and IL-8 were measured by ELISA; ACE2 protein expression was analyzed via immunofluorescence; and cell viability was assessed using the MTT assay. The results showed that both Sp and Ang II increased the expression of AT1R and MASR. Treatment with LOS and A-779 demonstrated that the expression of these components is mediated by their respective receptors, with Ang II pre-sensitization negatively modulating the Sp-induced receptor expression. ACE2 expression was upregulated independently of receptor activation; however, MASR blockade with A-779 further enhanced this effect. ACE2 protein levels were increased by Sp, possibly through an AT1R-dependent mechanism, while Ang II modulated ACE2 secretion. Both Sp and Ang II induced the expression and secretion of IL-1β and IL-8 in BSMCs, with Ang II effects being more pronounced at 12 hours. LOS inhibited the Sp-induced production of cytokines, highlighting the pro-inflammatory role of the Ang II/AT1R pathway. In contrast, MASR blockade with A-779 elevated cytokine levels at early time points, confirming its protective role. Pre-sensitization with Ang II reduced IL-1β and IL-8 levels, modulating the effects of Sp in a time-dependent manner. These findings underscore the active participation of the RAS pathway in SARS-CoV-2-induced inflammation in the airways.