Produção de L-asparaginase por Aspergillus niveus em fermentação em estado sólido (FES)
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Data
2019-04-12
Orientador
Guimarães, Luis Henrique Souza
Coorientador
Pós-graduação
Biotecnologia - IQ
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
A enzima L-asparaginase (L-asparagina amidohidrolase, EC 3.5.1.1) promove a hidrólise do aminoácido L-asparagina em ácido aspártico e amônia. Esta enzima é utilizada atualmente para o tratamento de leucemias, principalmente a Leucemia Linfoide Aguda (LLA), e na indústria de alimentos para minimizar a formação de acrilamida. Apesar de sua importância, a L-asparaginase tem alto custo de mercado e requer elevado grau de pureza para aplicação terapêutica. Além disso, a L-asparaginase disponível para uso terapêutico é de origem bacteriana, o que causa uma série de efeitos adversos, diminuindo a eficácia do tratamento. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi a obtenção de L-asparaginase a partir do cultivo de fungos filamentosos utilizando diferentes métodos de fermentação (submersa e estado sólido), selecionando as melhores condições para a sua produção e caracterizando a atividade da L-asparaginase presente no extrato bruto. A partir do rastreamento em meio solidificado em placa de Petri, o maior índice de hidrólise (IH = 2,8) foi obtido com o fungo Aspergillus niveus, o qual foi selecionado para conduzir a produção de L-asparaginase em fermentação submersa (FSbm) e em estado sólido (FES). A FES foi a fermentação selecionada uma vez que não foi detectada atividade L-asparaginolítica no filtrado obtido da FSbm. Desta forma, as influências de diferentes parâmetros (substrato, solução umidificante e tempo de cultivo) sobre a produção enzimática em FES foram analisadas. A mistura M1 constituída de farelo de trigo, soja moída e casca de laranja (1:0,5:1 m/m/m), umidificada com solução de sais Czapek Dox na proporção 1:0,5 (m/v) proporcionou maior produção enzimática (0,22 U/g de substrato), em 48 h de cultivo. A L-asparaginase presente no extrato bruto apresentou maior atividade na faixa de pH de 4,0-5,0 e de temperatura de 30-45ºC. A enzima foi estável por 2 h quando mantida no pH 5,0 e em uma ampla faixa de temperatura (30-65ºC) por 50 min. Alguns compostos favoreceram a atividade enzimática como CoCl2 e os solventes butanol, etanol, isopropanol e metanol. Já o surfactante SDS causou total inibição da atividade enzimática. Com este estudo foi possível constatar que o fungo A. niveus é uma potencial fonte de L-asparaginase, indicando que a FES pode ser utilizada para selecionar uma enzima mais específica e estável, a qual pode beneficiar tanto a indústria alimentícia, quanto a farmacêutica.
Resumo (inglês)
The L-asparaginase enzyme (L-asparagine amidohydrolase, EC 3.5.1.1) promotes the hydrolysis of the L-asparagine amino acid in aspartic acid and ammonia. This enzyme is currently used in the treatment of leukemias, mainly acute lymphoblastic leukemia (ALL), and in food industry to prevent the formation of acrylamide. Despite its importance, L-asparaginase has a high market cost and a high degree of purity is required for its therapeutic application. In addition, the L-asparaginase available for therapeutic use comes from bacteria which causes a number of adverse effects, de-creasing the effectiveness of the treatment. In this context, the aim of this study was the obtainment of a L-asparaginase from filamentous fungi culture using different fermentation methods (submerged and solid state), selecting the best conditions for its production and the characterization of the L-asparaginase activity present in the crude extract. After screening on solid medium in Petri dishes, the highest hydrolysis index (HI = 2.8) was obtained with the fungus Aspergillus niveus, which was selected for the production of L-asparaginase using both submerged fermentation (SF) and solid state fermentation (SSF). The SSF was the chosen fermentation since no L-asparaginolytic activity was detected in the SF. Thus, the influences of some parame-ters (as substrate, moisturizing solution and incubation time) on the enzymatic pro-duction in SSF were analyzed. The M1 mixture consisting of wheat bran, ground soybeans and orange peel (1:0.5:1 w/w/w), humidified with Czapek Dox salts solution in the ratio of 1:0.5 (w/v) provided the highest enzymatic activity (0.22 U/g of sub-strate) with 48 h of fermentation. The L-asparaginase present in the crude extract showed a higher activity in the pH range of 4.0-5.0 and temperature of 30-45ºC. The enzyme was stable at pH 5.0 for 2 h of incubation and under temperatures ranging from 30 to 65ºC for 50 min. Some compounds increased the enzyme activity such as CoCl2 and the solvents: butanol, ethanol, isopropanol and methanol. However, the SDS surfactant caused total enzymatic inhibition. It was possible to verify with this study that the fungus A. niveus is a potential source of L-asparaginase, indicating that the SSF can be used to select a more specific and stable enzyme, which can benefit both the food industry and the pharmaceutical industry.
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Idioma
Português