Teses - Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRC

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  • ItemTese de doutorado
    Análise funcional do miRNA-1914-5p no processo pró-esteatótico não alcoólico em cultura celular
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-03-21) Pansa, Camila Cristiane [UNESP]; Moraes, Karen Cristiane Martinez de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Nos últimos anos a prevalência das doenças hepáticas gordurosas não alcóolicas (DHGNA) tem aumentado no mundo. Esta condição é caracterizada pelo acúmulo desequilibrado de triglicerídeos no interior dos hepatócitos, e sua progressão pode levar a esteato-hepatite não alcoólica (EHNA), cirrose e até mesmo hepatocarcinoma. Diversas são as etiologias que contribuem para o desenvolvimento da DHGNA, dentre elas a obesidade, o diabetes, a genética e epigenética, agrotóxicos, vírus entre outros, o que complica ainda mais o desenvolvimento de terapias eficazes. Atualmente, o único tratamento para esta condição se baseia no estilo de vida e mudança nos hábitos alimentares dos indivíduos. Assim, buscar entender detalhes mecanísticos que subsidiem ao desenvolvimento de novas drogas é pertinente. Dessa maneira o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade funcional do miRNA-1914-5p, baseado em estudos proteômicos e análises bioquímica, na biologia do sistema de células hepáticas em condições de pró-esteatose. As análises dos resultados proteômicos apontaram mecanismos reguladores do ambiente pro-esteatótico, entre os quais, o processo epigenético que foi avaliado em ensaios bioquímicos e análises de expressão gênica (qPCR e western blotting). Estas analises evidenciaram que a presença do miRNA 1914-5p no processo de pró-esteatose levou a maior perturbação do equilíbrio celular por aumento das proteínas HSP e a presença da proteína HSP5, sinalizadora de estresse do retículo endoplasmático, além de possível progressão da DHGNA com o aumento da expressão gênica de MAT2A e MAT2B. Contrariamente, a inibição do miRNA-1914-5p, apresentou atenuar os processos de pró-esteatose por possível aumentou das expressões de genes fundamentais da via do 1-carbono (1C) como AHCY, MTHFRD2 e MTR, além de apresentar possível consumo exacerbado de GSH, pertencente a via da transsulfuração, anexa a via do 1C, para a recuperação do equilíbrio e homeostasia celular. Em conclusão, a inibição do miRNA-1914-5p, apresentou atenuar a condição de pró-esteatose no modelo de co-cultura por possível atuação na via do 1C e facilitação do consumo exacerbado de GSH. Entretanto mais investigações são necessárias para melhor compreender de fato a atuação deste miRNA na via da do 1C e na via da transsulfuração.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação de efeitos da exposição oral de abelhas sem ferrão e melíferas ao flupiradifurona
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-12-06) Dorigo, Adna Suelen [UNESP]; Malaspina, Osmar [UNESP]; Nocelli, Roberta Cornélio Ferreira [UNESP]; Rosa-Fontana, Annelise de Souza; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O atual cenário brasileiro de uso de agrotóxicos nos sistemas agrícolas, somado à necessidade do estabelecimento de políticas públicas de proteção a polinizadores, requer estudos sobre os potenciais efeitos destes produtos químicos sobre organismos não-alvo. Além de se avaliar as taxas de mortalidade, é essencial que possíveis efeitos subletais sejam considerados. Dessa forma, o presente estudo teve como objetivos: (i) compreender os possíveis efeitos subletais do inseticida flupiradifurona larvas de abelhas Apis mellifera, Melipona scutellaris e Scaptotrigona postica expostas oralmente. (ii) analisar a atividade de biomarcadores enzimáticos em larvas expostas a doses realistas de campo do inseticida flupiradifurona. (iii) avaliar o impacto da exposição do flupiradifurona na fase larval e em abelhas recém-emergidas sobre o sistema imune das abelhas, por meio da contagem de hemócitos. Para tanto, (i) larvas das espécies A. mellifera; S. postica e M. scutellaris foram expostas ao inseticida Flupiradifurona (grupo D - 0,77 ng i.a/μL de alimento; grupo DC 7,7 ng i.a/μL de alimento). Foram observados os efeitos de acordo com a progressão das fases de desenvolvimento: 5ª instar larval; defecação; taxa de mortalidade; taxa de pupação; taxa de emergência; mudança na coloração de olhos das pupas e; tempo em cada fase de desenvolvimento. Os dados obtidos foram submetidos a análises estatísticas no software RStudio. Os resultados demonstraram que o flupiradifurona afetou significativamente todos os parâmetros larvais em ambos os grupos expostos, quando comparados ao controle demonstrando que o flupiradifurona pode ser considerada tóxico para abelhas em sua fase de desenvolvimento. (ii) larvas das espécies A. mellifera; S. postica e M. scutellaris foram expostas ao inseticida Flupiradifurona (grupo D - 0,77 ng i.a/μL de alimento; grupo DC 7,7 ng i.a/μL de alimento) e 15 delas foram coletadas 24 horas após o término da alimentação. Foram realizadas a modulação da atividade enzimática das enzimas acetilcolinesterase (AChE), glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GP), carboxilesterase (CaEs p), glicose -6- fosfato desidrogenase (G6PDH), glutationa s- transferase (GST), glicose oxidase (GOX), fenol oxidase (POX) e fosfatase alcalina (PAL). Os resultados mostraram sua eficácia na identificação de efeitos subletais, apontando diferentes respostas da exposição para as espécies de abelhas analisadas. Dessa forma, o uso dessas ferramentas moleculares demonstra grande potencial para serem incluídas em futuras decisões de órgãos regulatórios para análise de risco. (iii) larvas das espécies A. mellifera; S. postica e M. scutellaris foram expostas ao inseticida Flupiradifurona (grupo D - 0,77 ng i.a/μL de alimento; grupo DC 7,7 ng i.a/μL de alimento) e para este teste foram coletadas larvas 24 horas após o término da alimentação e abelhas recém-emergidas (24 horas após a emergência). Foi coletada a hemolinfa desses indivíduos e adicionado ao corante azul de metileno para visualização em microscópio eletrônico. Através de análises estatísticas podemos inferir que o uso de flupiradifurona pode comprometer o sistema imune dessas abelhas, podendo levar a morte tanto do indivíduo quanto da colônia. Os resultados obtidos são inéditos e contribuem para o desenvolvimento de medidas protetivas para a conservação das espécies A. mellifera, S. postica e M. scutellaris, uma vez que este estudo é o primeiro a avaliar os efeitos da exposição larval ao flupiradifurona para essas espécies. Desse modo, esse trabalho fornece dados pioneiros para a literatura científica, com relavância a serem incluídos nas avaliações de risco ambientais realizadas pelo IBAMA.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação dos efeitos ecotoxicológicos das aminas biogênicas cadaverina e putrescina, por meio de ensaios com diferentes sistemas-teste
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-28) Braga, Ana Paula Andrade; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O crescimento desenfreado da população mundial, que acontece concomitantemente com as atividades antrópicas, ocasionou sérios impactos negativos ao meio ambiente e à saúde pública. Atualmente, os cemitérios têm se destacado neste quesito, sendo considerados uma das fontes mais relevantes da poluição urbana que impacta recursos hídricos e solos. A decomposição do corpo humano é o processo mais preocupante nestes ambientes, principalmente devido a liberação do necrochorume, líquido resultante da putrefação dos corpos. As aminas biogênicas cadaverina e putrescina são substâncias que compõe o necrochorume, responsáveis pelo odor fétido da decomposição cadavérica. Ambas as substâncias apresentam potencial tóxico para diferentes organismos, incluindo seres humanos. Apesar do conhecimento sobre o risco proveniente de cemitérios, poucos estudos avaliaram a ecotoxicidade dos subprodutos oriundos da decomposição humana. Considerando o aumento constante das atividades cemiterias, bem como a lacuna de informações sobre os efeitos de seus contaminantes, fica evidente a necessidade de mais pesquisas que abordem a toxicidade do necrochorume. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar as toxicidades da cadaverina e putrescina, de forma isolada e em mistura, por meio de diversos ensaios com diferentes bioindicadores aquáticos e terrestres. A espécie Lactuca sativa foi utilizada para avaliar a fitotoxicidade dessas aminas, pelos ensaios do índice de germinação de sementes e mensuração do eixo hipocótilo-radicular. A citogenotoxicidade e potencial mutagênico, foram avaliados pelos ensaios do índice mitótico, de indução de aberrações cromossômicas e do teste de micronúcleos, respectivamente, em células meristemáticas de Allium cepa. Os colêmbolos da espécie Folsomia candida foram empregados para avaliação da ecotoxicidade, por meio do ensaio comportamental de fuga e reprodução. A toxicidade das aminas biogênicas também foi avaliada com os bioindicadores aquáticos Daphnia magna, pelo parâmetro de letalidade e Danio rerio, por meio dos ensaios de letalidade e embriotoxicidade. Neste estudo, também foi realizada uma revisão bibliográfica sobre o uso do zebrafish como modelo animal em ensaios ecotoxicológicos. Os resultados com L. sativa demonstraram efeito fitotóxico para a cadaverina e putrescina (diminuição do crescimento radicular e do hipocótilo), tanto de forma isolada como em mistura. Os efeitos foram mais significativos nos ensaios realizados com as associações das aminas biogênicas. Pelos ensaios realizados com A. cepa, foi observada maior citotoxicidade (distúrbios no ciclo celular) para as associações das aminas, do que nos testes isolados. A maior concentração avaliada (1000 mg. Kg-1) foi capaz de inibir a divisão celular em mais de 80%. Pelos resultados dos testes de genotoxicidade e de potencial mutagênico, realizados com as aminas biogênicas isoladas, apenas a cadaverina foi genotóxica e potencialmente mutagênica para A. cepa. Por este teste, a putrescina não apresentou resultado significativo, quando comparado ao controle negativo. Contudo, as mistura das aminas potencializaram o efeito genotóxico e o potencial mutagênico desses compostos (aumento significativo de aderência cromossômica, poliploidia e broto nuclear, assim como o aumento da formação de micronúcleos). Os resultados para o teste de fuga com F. candida mostraram que os indivíduos tiveram preferência para o solo tratado com as aminas biogênicas, portanto não expressaram comportamento de fuga. No entanto, foram observados efeitos negativos da cadaverina e putrescina sobre a reprodução dos colêmbolos, comprovando um efeito a longo prazo dessas aminas (diminuição do número de juvenis), principalmente para as substâncias associadas. Com relação à letalidade de D. magna, a cadaverina induziu maior letalidade (CL50 9,5 mg. L-1) que a putrescina (CL50 36,7 mg. L-1). Neste ensaio, não foi observado potencialização dos efeitos, para as associações das aminas biogênicas. Cadaverina também induziu maior letalidade para D. rerio (CL50 335,5 mg. L-1), em relação à putrescina (CL50 452,6 mg. L-1). Os resultados para embriotoxicidade foram significativos nos ensaios realizados com as misturas de cadaverina e putrescina (atraso na eclosão, malformação da coluna e edema de pericárdio). Pelos resultados obtidos neste estudo, pode-se inferir que as aminas cadaverina e putrescina apresentam potencialidade tóxica para diferentes organismos. O estudo realizado traz importantes informações que contribuem para melhor conhecimento da toxicidade de substâncias derivadas de processos putrefativos, comuns em ambientes de cemitérios, uma vez que existem poucos estudos realizados na área ecotoxicológica desses ambientes.
  • ItemTese de doutorado
    Caracterização funcional do aminoácido hipusina
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-02-24) Tamborlin, Leticia [UNESP]; Luchessi, Augusto Ducati [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O aminoácido hipusina [Nε-(4-amino-2-hidroxibutil)-lisina] foi isolado pela primeira vez em 1971 a partir de extratos de cérebro bovino. A hipusina origina-se a partir de uma modificação pós-traducional que ocorre no fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A), uma proteína altamente conservada produzida por arqueobactérias e eucariotos. A proteína eIF5A é a única descrita contendo o resíduo de aminoácido hipusina, o qual é essencial para sua atividade. A hipusina como aminoácido livre é consequência da degradação proteolítica de eIF5A. Neste trabalho, mostramos pela primeira vez evidência de atividade biológica para a hipusina livre. Para isso, células C6 derivadas de glioma de rato foram tratadas com hipusina e diferentes parâmetros celulares foram avaliados. O tratamento com hipusina reduziu significativamente a proliferação de células C6 e suprimiu fortemente sua capacidade clonogênica sem levar as células à apoptose. O tratamento com hipusina também diminuiu o conteúdo do transcrito codificador de eIF5A e o perfil global de síntese proteica, o que pode ter ocorrido devido a um feedback negativo em resposta à alta concentração de hipusina adicionada de forma exógena. A hipusina pode ter afetado o conteúdo e/ou a hipusinação da proteína eIF5A recém-sintetizada, o que pode ter levado a uma estagnação no processo de tradução. Além disso, o tratamento com hipusina também alterou o metabolismo celular, por meio da regulação das vias para a produção de energia, reduzindo a respiração celular acoplada à fosforilação oxidativa e aumentando o metabolismo anaeróbico, evidenciado pelo aumento da produção de lactato. Esses resultados e a relação entre eIF5A e o processo de desenvolvimento tumoral nos levaram a testar a associação da hipusina com o quimioterápico temozolomida. A combinação de temozolomida com hipusina reduziu a conversão do MTT para os mesmos níveis observados utilizando o dobro da dose de temozolomida isoladamente, demonstrando então uma ação sinérgica entre os compostos. Assim, desde 1971, este é o primeiro estudo que mostra evidência de atividade biológica para a hipusina como um aminoácido livre e não como um componente essencial para a atividade da proteína eIF5A.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação do potencial tóxico da vinhaça após a fitorremediação empregando diferentes organismos testes
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-10-25) Souza, Cleiton Pereira de [UNESP]; Christofoletti, Carmem Silvia Fontanetti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Embora o álcool possa ser produzido por meio de diversas matérias-primas, sua produção utilizando a cana-de-açúcar é bastante expressiva, em especial no Brasil. Em média, durante a produção do álcool, para cada litro gerado é produzida uma quantidade de 13L de vinhaça. A principal fonte de destinação deste resíduo é a fertirrigação de solos agrícolas. No entanto, devido as suas características físico-químicas o uso da vinhaça na fertirrigação pode oferecer riscos para ecossistemas aquáticos e terrestres. Diversos estudos para a avaliação da toxicidade da vinhaça bruta têm conciliado o uso de diferentes bioindicadores com as análises físico-químicas para melhor compreender a toxicidade desse resíduo, já bem evidenciada em diferentes organismos vivos. Tendo em vista a toxicidade causada por este resíduo, inúmeros métodos físicos, químicos e biológicos têm sido empregados em seu tratamento no intuito de diminuir sua toxicidade. Nesse contexto, o presente estudo teve por objetivo investigar a toxicidade da vinhaça de cana-de-açúcar fitorremediada por meio de um sistema híbrido de tratamento, empregando diferentes bioindicadores e biomarcadores. Foram empregados Allium cepa (cebola) para avaliar fitotoxicidade, por meio da germinação e crescimento de raiz, e a citogenotoxicidade, por meio da análise de aberrações cromossômicas e presença de micronúcleos nas células meristemáticas das raízes. Diplópodos (Rhinocricus padbergi) foram utilizados para análises histopatológicas que evidenciam a toxicidade no intestino médio desses animais. Colêmbolos (F. candida) foram empregados para avaliação da ecotoxicidade por meio dos testes padronizados de comportamento de fuga e reprodução. Os resultados do presente trabalho indicam que a vinhaça fitorremediada foi mais tóxica nos níveis biológicos mais basais (celular e tecidual) em A.cepa e R. padbergi. Apesar da vinhaça fitorremediada ter atraído os colêmbolos, provavelmente, devido a sua alta quantidade de matéria orgânica, não reduziu a reprodução dos colêmbolos. Com base nos dados presentes na literatura que evidenciam a toxicidade da vinhaça bruta, infere-se com os resultados do presente estudo que a vinhaça fitorremediada apresenta um menor potencial tóxico, mas ainda pode provocar danos nos organismos empregados no presente estudo.
  • ItemTese de doutorado
    Ação in vitro e in vivo do ozônio sobre células de linhagem embrionária (RML-RSE e ISE6) e fêmeas adultas de carrapatos Rhipicephalus linnaei semi ingurgitadas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2023-01-06) Abreu, Marina Rodrigues de [UNESP]; Camargo, Maria Izabel Souza [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A espécie Rhipicephalus sanguineus l. s. (R. linnaei) mais conhecida como “carrapato do cão”, possui uma grande importância médico-veterinária, não só por espoliar seus hospedeiros, mas também por ser um potencial vetor de agentes patogênicos. Dessa forma, inúmeros estudos vêm buscando métodos eficazes de controle desse hematófago, e atualmente, as estratégias mais utilizadas para seu controle tem sido o uso de acaricidas químicos sintéticos, porém, a aplicação indiscriminada desses químicos tem provocado enormes desvantagens como a seleção de linhagens mais resistentes de carrapatos, risco de toxicidade aos hospedeiros e a saúde humana, e contaminação ambiental. Portanto, novas alternativas eficazes de controle desse ectoparasita precisam ser avaliadas. O ozônio vem sendo relatado na literatura como agente oxidante com potencial ação antimicrobiana, desinfetante, esterilizante e cicatrizante e suas propriedades têm sido amplamente exploradas na indústria alimentícia, na desinfecção de ambientes hospitalares, e recentemente também no controle de pragas agrícolas. Nesse sentido, surgiu a hipótese de sua ação como agente acaricida para o controle de carrapatos, e embora algumas informações na literatura já indiquem esse caminho, pouco se estudou a respeito do seu efeito acaricida e principalmente como funcionam os mecanismos de ação sobre a exposição dos tecidos e das células desses ectoparasitas a essa substância. Diante do exposto, o presente estudo propôs estudar os mecanismos de ação do ozônio (água ozonizada) sobre fêmeas adultas de carrapato R. sanguineus l. s. (R. linnaei) in vivo e culturas de células de linhagem embrionária (RML- RSE e ISE6) in vitro avaliando os efeitos apresentados por tal substância nos diferentes modelos celulares e teciduais. Os resultados mostraram que o ozônio (água e óleo ozonizado) pode ser considerado um potencial acaricida natural com ação em carrapatos da espécie R. sanguineus l.s. (R. linnaei), provocando nestes toxicidade, confirmada pelas alterações morfofisiológicas encontradas tanto nos órgãos desses ectoparasitas (glândulas salivares, ovário, órgão de Gené e integumento), bem como alterando os parâmetros biológicos reprodutivos, a viabilidade celular e a expressão gênica de células embrionárias de carrapatos.
  • ItemTese de doutorado
    Análise dos efeitos de associações das aminas biogênicas cadaverina e putrescina sobre cultura de fibroblasto de anfíbios e células hepáticas humanas, cultivadas em sistema 2D
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-08-24) Gonçalves, Letícia Rocha [UNESP]; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A problemática ambiental promovida pelo desenvolvimento da sociedade humana é um dos grandes desafios do século XXI. Dentre as principais fontes antrópicas de contaminação ambiental, estão os cemitérios. O principal contaminante desses ambientes é um líquido tóxico, derivado da putrefação cadavérica, denominado de necrochorume. Neste líquido são encontrados contaminantes químicos orgânicos e inorgânicos e biológicos, altamente detrimentais à saúde humana, à biota endêmica (incluindo à vida animal) e ao ambiente adjacente. O potencial tóxico do necrochorume é, principalmente, devido às substâncias orgânicas presentes em sua composição, como as aminas biogênicas, cadaverina (CAD) e putrescina (PUT). Ambas, são naturalmente sintetizadas por praticamente todos os seres vivos em concentrações micromolares e apresentam funções essenciais nos processos de diferenciação, crescimento e morte celular dos organismos. Contudo, em altas concentrações têm potencial citogenotóxico e até carcinogênico. Todos os compostos gerados durante a decomposição dos corpos podem contaminar o solo e os recursos hídricos (águas subterrâneas e superficiais) podendo persistir no ambiente por tempos variáveis, o que confere um alto potencial contaminante para o necrochorume. Por toda essa problemática somada ao aumento no número de mortes pela pandemia da COVID-19, torna-se necessário o desenvolvimento de mais estudos de ampla abordagem dos impactos do necrochorume sobre a saúde ambiental. No presente estudo, foram consultadas bases de dados científicos eletrônicos (NCBI); publicações de agências governamentais (por exemplo, ARPEN, Brasil); agências ambientais (por exemplo, OMS, OurWorldInData.org); sites confiáveis disponíveis gratuitamente (por exemplo, CNN); e revistas científicas relacionadas ao tema, para levantar informações sobre os impactos de contaminantes de cemitérios sobre a biota e saúde humana, bem como os impactos da pandemia na geração desses contaminantes. Foram desenvolvidos ainda estudos do potencial tóxico de associações das duas aminas biogênicas (CAD e PUT) presentes no principal contaminante de cemitérios (necrochorume), para melhor avaliar o modo de ação conjunta dessas substâncias. Linhagens celulares de anfíbio e de seres humanos foram expostas a diferentes associações dessas aminas, para avaliação da citogenotoxicidade e do potencial mutagênico (ensaios da resazurina, cometa e micronúcleo) das mesmas. Foi também avaliado, com as mesmas linhagens celulares, o perfil do ciclo celular, por citometria de fluxo, e o indicativo de morte das células, pela fragmentação do DNA da associação de CAD e PUT. A linhagem HepG2/C3A ainda foi submetida aos ensaios de avaliação da expressão gênica, para os genes relacionados a via de estresse oxidativo (CAT, SOD1A1, GSTM4, GSR), metabolismo de xenobiontes (CYP1A1), reparo do DNA (ERCC e CHECK1), morte celular (p53 e c-MyC) e apoptose (caspase 3 e capsase 9) (dados adicionais). Os resultados obtidos com a linhagem celular Speedy indicaram citotoxicidade para as associações de maiores concentrações de CAD (20 e 10%) e PUT (10 e 0,1%), igualmente para as associações com 20% de CAD e com 10% de PUT, independente da concentração da bioamina associada. Em baixas concentrações, as aminas testadas induziram efeito aneugênico sobre as células Speedy, quando em exposição por 24 h. Já para as exposições celulares de 48h, a concentração mais alta das aminas (CAD 20% e PUT 10%) induziu fragmentação do DNA e parada do ciclo celular na fase S. Assim, os efeitos tóxicos, para a linhagem celular Speedy, foi tempo dependente da exposição. Em relação à linhagem celular HepG2/C3A, as associações de CAD e PUT no tempo de 24 h de exposição indicaram genotoxicidade e indicativo de potencial mutagênico por efeitos de origem aneugênica e clastogênica para todas as concentrações testadas CAD (20 e 30%), associada a PUT (10 e 30%) e ainda nessas mesmas concentrações foi observado uma diminuição na expressão dos genes CHECK1,CAT, GSTM4, GSR, CYP1A, p53, c-MyC, caspase 3 e capsase 9 e aumento da expressão dos genes ERCC1 para CAD (20 e 30%) associada a PUT (10%) e SOD1A para CAD (20%) e PUT (30%). Análises em citômetro de fluxo indicaram fragmentação no DNA no tempo de 24h e 48h de exposição para a concentração de CAD (30%) e PUT (70%). Essas informações comprovam os perigos das aminas presentes no necrochorume, tanto à saúde como ao ambiente, portanto alertam sobre os impactos negativos das contaminações de áreas cemiteriais. Os ensaios com as células Speedy e HepG2/C3A mostraram que as aminas biogênicas aqui avaliadas são potencialmente genotóxicas e com potencial mutagênico para diferentes vertebrados, indicando que podem desencadear problemas à saúde de trabalhadores, visitantes, da população e de todo ecossistema que vive no entorno de cemitérios.
  • ItemTese de doutorado
    Escovopsioides nivea (Ascomycota: Hypocreales): antagonista de fungos cultivados pelas formigas atíneas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2022-04-01) Pietrobon, Tatiane de Castro [UNESP]; Rodrigues, Andre [UNESP]; Kooij, Pepijn Wilhelmus; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Interações entre organismos são comuns na natureza e responsáveis por manter o equilíbrio dos ecossistemas. O mutualismo entre as formigas atíneas e fungos é um exemplo clássico de simbiose. Esses insetos cultivam o parceiro fúngico como fonte de alimento, e este recebe proteção, além de ser disperso pelas formigas. Ambos os organismos co-evoluíram levando à formação de cinco diferentes tipos de fungiculturas. Um antagonista alvo de estudo desse sistema é o fungo do gênero Escovopsis, considerado parasita do fungo cultivado pelas formigas. Estudos revelaram que esse fungo coevoluiu com o sistema e que o parasitismo é mediado por substâncias químicas. Fungos do gênero Escovopsioides, filogeneticamente relacionados a Escovopsis, também são encontrados nas colônias das formigas atíneas. Escovopsioides é um possível antagonista do fungo mutualista das atíneas, entretanto, pouco se conhece sobre a diversidade filogenética e o real papel desse fungo no ambiente das formigas atíneas. Os objetivos do presente estudo foram descrever a diversidade e o papel de Escovopsioides na interação das formigas atíneas com o fungo cultivado. Como poucos isolados desse fungo são conhecidos, ampliamos as amostragens desse gênero com coletas de jardins de fungo de formigas atíneas em diferentes localidades do país. Os isolados obtidos foram identificados por sequenciamento genético. Nosso estudo sugere que apenas uma espécie de Escovopsioides, E. nivea, está associada ao ambiente das formigas atíneas como um simbionte. Em seguida, bioensaios de co-cultivo foram realizados entre E. nivea e os fungos mutualistas de quatro, dentre cinco, diferentes tipos de fungiculturas das formigas atíneas. Bioensaios semelhantes foram utilizados para analisar os metabólitos envolvidos nessas interações. Nossos resultados demonstraram que E. nivea é um antagonista, pois inibe o crescimento de diversos fungos cultivados pelas atíneas. É possível metabólitos difundidos no meio de cultivo sejam os responsáveis pelo antagonismo observado, entretanto, outros fatores também podem estar envolvidos, como substâncias voláteis e/ou competição por nutrientes.
  • ItemTese de doutorado
    Molecular composition and evolution of b chromosomes in neotropical grasshoppers: a cytogenomic approach
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-12-08) Milani, Diogo [UNESP]; Cabral-de-Mello, Diogo Cavalcanti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Cromossomos supranumerários ou Bs são elementos dispensáveis adicionais que estão presentes em alguns indivíduos em uma determinada população de uma determinada espécie. Até agora, estima-se que estejam presentes em mais de 15% dos eucariotos, incluindo plantas, fungos e animais. Uma das principais características dos Bs é que eles não se recombinam com o complemento A, evoluindo independentemente do resto do genoma. Eles também podem se acumular ao longo de gerações por forças evolutivas ainda não muito conhecidas como resultado de impulsos por distorção do padrão normal de herança de Mendel. Uma característica muito comum dos cromossomos B é sua heterocromatinização e acúmulo de DNAs repetitivos, responsáveis por sua evolução e diferenciação em relação ao complemento A. Genes funcionais associados principalmente à divisão e regulação cromossômica também foram documentados. Apesar dos ortópteros apresentarem grande número de espécies portando cromossomos B, estudos com abordagens recentes usando a integração entre sequenciamento genômico e mapeamento cromossômico físico para melhor entendimento sobre origem, composição, evolução e comportamento estão concentrados principalmente em algumas espécies. Aqui, nosso objetivo foi elucidar a composição molecular e possível ancestralidade dos cromossomos B em diferentes gafanhotos neotropicais, com uma extensão para entender a dinâmica populacional do cromossomo B de Abracris flavolineata. O presente trabalho teve basicamente três etapas principais apresentadas em três manuscritos. No primeiro, por análise de satDNAs, fornecemos suporte para a origem intraespecífica do cromossomo B de Rhammatocerus brasiliensis, Schistocerca rubiginosa e Xyleus discoideus angulatus, a partir de cromossomos pequenos, o que parece ser uma característica comum para este grupo. O segundo capítulo apresentou o cromossomo B eucromático incomum de A. flavolineata que diferentemente a outros Bs poderia ser um elemento jovem, não enriquecido com DNA repetitivo, mostrando padrão C-negativo e alta semelhança com o complemento A. Esses resultados obtidos por sequenciamento genômico, bioinformática e mapeamento cromossômico, sugerem uma origem intraespecífica do cromossomo B a partir do par L1, provavelmente passando por misdivisão e formação de isocromossomo. Finalmente, no terceiro capítulo, mais dois Bs foram encontrados em populações de A. flavolineata com frequências diferente e composição altamente diferenciada. As evidências obtidas pela análise do repeatoma reforçaram que os Bs são jovens, mas em diferentes estágios de heterocromatinização, principalmente devido à intensa amplificação de repetições de satDNA, como observado para o B da população da Argentina. A variante do B da população de Cabo/PE apresentou mais semelhança com a variante de Rio Claro/SP do que a de Posadas/ARG. Além disso, a origem única das variantes de Bs das populações de A. flavolineata é discutida.
  • ItemTese de doutorado
    Prospecting new compounds with antimicrobial action to control of contaminants in fuel ethanol fermentation
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-11-12) Ranke, Fabiane Fernanda de Barros; Oliva Neto, Pedro de [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As bactérias ácido láticas são contaminantes comuns na indústria do bioetanol. Alguns tratamentos têm sido utilizados para reduzir a contaminação bacteriana na fermentação, porém seus usos são limitados devido ao alto custo, resistência bacteriana, toxicidade para a levedura, regulamentações e aspectos ambientais. Essa pesquisa teve como objetivo estudar novos produtos (de síntese química e natural) com propriedade antimicrobiana, livres ou imobilizados em suportes naturais, a fim de substituir ou melhorar a eficiência das moléculas atualmente utilizadas na indústria para o controle de Limosilactobacillus fermentum. Os testes de atividade antimicrobiana in vitro determinaram a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de 0,8 a 0,9 mg L-1 de Monensina Sódica (MS) e 150 mg L-1 a 230 mg L-1 de Dióxido de Cloro (DC), algumas das principais moléculas utilizadas atualmente. Os corantes Violeta Genciana (VG) e Azul de Metileno (AM) também foram estudados como alternativa e demonstraram ação antibacteriana em 20 mg L-1 e 60 mg L-1, respectivamente. Além disso, VG e MS podem atuar sinergicamente com CIM de 10 e 0,5 mg L-1. Testes com AM e DC mostraram sinergia com CIM de 40 mg L-1 para AM e 125 mg L-1 para DC. A imobilização de VG em grânulos de Alginato/Semente de Abacate (Al/Av) apresentou 100% de inibição a 100 mg L-1 de corante, após 48 h de incubação a 37 °C em meio MRS. Esta técnica não foi eficaz na adsorção do AM, que se desprendeu facilmente do gel durante o processo de incubação. Os grânulos de VG Al/Av mostraram eficácia em 42 reciclos, comprovando sua estabilidade e eficácia. Foram testados os sobrenadantes delevurados do cultivo das leveduras Sporobolomyces japonicus, Sporidiobolus pararoseus, Rhodotorula mucilaginosa and Saccharomyces cerevisiae M-26, que não mostraram inibição de L. fermentum nas condições testadas. Na triagem dos extratos vegetais, Eucalyptus urograndis inibiu L. fermentum e o extrato de Agave americana inibiu S. cerevisiae, ambos nas concentrações de 10.000 mg L-1. O extrato de eucalipto não foi tóxico para S. cerevisiae, no entanto houve inibição parcial de L. fermentum em cultura mista com S. cerevisiae em fermentação Fed-batch. O óleo essencial de alecrim mostrou ação antibacteriana com CIM de 103 mg L-1 em processo de Fed-batch em cultura mista após 5 reciclagens celulares, com alto rendimento etanólico e sem efeito contra S. cerevisiae, sugerindo que esse óleo deve ser mais estudado para aplicações industriais.
  • ItemTese de doutorado
    Desvendando a química ecológica de captura de presas pela teia das aranhas Trichonephila clavipes e Trichonephila plumipes através de abordagens ômicas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-09-10) Esteves, Franciele Grego; Palma, Mario Sergio [UNESP]; Pinto, José Roberto Aparecido dos Santos [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A aranha Trichonephila clavipes pertence ao grupo das aranhas construtoras de teia orbital, que constroem teias grandes e circulares para capturar suas presas. Através de uma glândula produtora de seda denominada de agregada, essas aranhas depositam gotículas oleosas que recobrem os fios da espiral de captura. Essas gotículas oleosas contêm muitas vesículas lipídicas que aprisionam em seu interior soluções de proteínas, peptídeos e compostos de baixas massas moleculares. Dentre essas moléculas muitas são toxinas de natureza proteica e de baixas massas moleculares, as quais podem, por exemplo, paralisar as presas no momento em que as mesmas entram em contato com a teia. Especula-se que quando um inseto-presa é aprisionado pela teia, as gotículas e vesículas lipídicas desempenham um papel importante em penetrar, armazenar, transportar, e por fim, liberar as toxinas para o interior do corpo da presa. Considerando isso, utilizando análises de espectrometria de massas, foi possível identificar seis classes de lipídios que compõem as gotículas e vesículas lipídicas da teia. Dentre elas, principalmente os ácidos e ésteres graxos, além de fosfolipídios do tipo glicerofosfolipídio e esfingolipídios, e também glirecerolipídios e esterolipídios. Posteriormente, através da análise quantitativa do extrato vesicular da teia, foi possível estimar que para uma única teia, o extrato vesicular apresentou em média 14.709.800 vesículas lipídicas, com um valor expresso em massa de 700µg de proteínas/peptídeos; de forma que cada vesícula possivelmente aprisiona em seu interior ≅ 47 pg de proteínas/peptídeos que provavelmente correspondem às toxinas que paralisam o inseto-presa no momento em que as mesmas são liberadas para o interior do corpo do inseto. Até o momento não se sabe muito sobre a composição peptídica da teia, dessa forma, através da análise do perfil de peptídeos por LC-MS/MS, foram identificados um total de 729 peptídeos presentes na seda da teia e nas glândulas produtoras de seda da aranha T. clavipes, sendo que 13 peptídeos foram selecionados e sintetizados em fase sólida, para que posteriormente o potencial tóxico dos mesmos fossem avaliados em ensaios de inseto-toxicidade. Foi observado que tanto o extrato vesicular da teia como os peptídeos Trichonephiline-1, -2, -3, -4, -8, 10 e 13 apresentaram efeitos tóxicos quando injetados na hemocele de abelhas. O extrato vesicular da teia apresentou valor de DL50 = 0,323 ng/mg enquanto os peptídeos Trichonephiline-1, -2, -3 apresentaram valor de de DL50 = 1,06 ng/mg, 0,846 ng/mg e 1,06 ng/mg, respectivamente. Além disso, quando submetidos a ensaios de Fluorescence Imaging Plate Reader (FLIPR), os peptídeos Trichonephiline-1, -2, -3, -4, -8, 10 e 13 também apresentaram ação inibitória em canais de íons sódio (Nav) e cálcio (Cav2.2). O peptídeo Trichonephiline-8 também inibiu canais de íons cálcio (Cav1.3) e o receptor nicotínico de acetilcolina alfa 7 (nAChRα7), enquanto o peptídeo Trichonephiline-10 inibiu apenas o receptor nAChRα7. Além dos peptídeos potenciais inseticidas envolvidos na captura de presas, o peptídeo Trichonephiline-6 foi identificado com ação antibiótica (MIC <= 0,25 ug/mL) para a bactéria Gram+ Staphylococcus aureus. O extrato total da teia também apresentou ação antibiótica com valor de MIC ≤ 2 µg/mL para a bactéria Gram- Pseudomonas aeruginosa. Tanto a seda da teia quanto o peptídeo Trichonephiline-6 podem estar contribuindo no mecanismo de defesa da teia para que a seda, ou até os ovos da aranha em desenvolvimento, resistam à decomposição microbiana. Finalmente, foi realizada pela primeira vez a análise de imageamento químico por espectrometria de massas (IMS-MALDI) da seda da teia da aranha T. plumipes, a qual evidenciou que a distribuição dos peptídeos na teia ocorre de forma heterogênea. Dessa forma, os resultados obtidos na presente tese forneceram uma melhor compreensão químico-ecológica da captura de presas pelas teias das aranhas do gênero Trichonephila, além de servir de inspiração para o desenvolvimento de novos inseticidas-seletivos e/ou antibióticos.
  • ItemTese de doutorado
    Filogenia e biogeografia do gênero Atta Fabricius, 1804 (Formicidae: Attini) a partir de Elementos Ultra-conservados (UCEs): evidências de recente e rápida especiação.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-25) Barrera, Corina Anahí; Bacci Júnior, Maurício [UNESP]; Rabeling, Christian; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As formigas cortadeiras são herbívoros dominantes na Região Neotropical. Elas são importantes engenheiros de ecossistemas e muitas espécies são pragas agrícolas de grande importância ecológica e econômica. As formigas cortadeiras do gênero Atta Fabricius estão amplamente distribuídas nas Américas. As relações filogenéticas dentro do gênero permanecem incertas e a delimitação e identificação de algumas espécies de Atta são problemáticas. Aqui, abordamos essas incertezas empregando marcadores filogenômicos (Elementos Ultra-conservados ou UCEs) em uma análise que inclui 2340 loci de UCE de 224 espécimes Atta de toda a distribuição geográfica do gênero e 49 espécimes como grupos externos. Nossos resultados indicaram a monofilia do gênero Atta e das 14 espécies estudadas (das 15 espécies conhecidas e identificáveis) com alto suporte, representando a estimativa filogenética mais abrangente até o momento para este gênero de formigas cortadeiras. Dentro do gênero Atta, recuperamos quatro clados bem sustentados que coincidem com os grupos de espécies previamente recuperados e correlacionados com os subgêneros anteriormente descritos, Archeatta Gonçalves, Atta s.s. Emery, Epiatta Borgmeier e Neoatta Gonçalves. O clado Archeatta contém três espécies que ocorrem na América do Norte, Central e no Caribe e é o grupo irmão de todas as outras espécies de Atta. O clado Atta s.s. é composto por duas espécies que ocupam as América do Norte, Central e do Sul. O clado Epiatta contém sete espécies exclusivamente sul-americanas, e as duas espécies do clado Neoatta ocorrem na América Central e do Sul. Nossas análises identificaram uma série de eventos importantes no Mioceno, como a origem das formigas cortadeiras há 18.9 milhões de anos (Ma), a divergência de Acromyrmex Mayr e Atta por volta de 16.7 Ma e a origem do grupo crown de Atta por volta de 8.5 Ma. As espécies de Atta existentes evoluíram muito recentemente, originando-se no início do Pleistoceno, aproximadamente entre 1.8 e 0.3 Ma (idade do grupo crown). O clado Neoatta inclui Atta robusta Borgmeier, a espécie do grupo crown mais jovem do gênero, com idade de 0.3 Ma. Nossa filogenia forneceu a primeira evidência de que Atta goiana Gonçalves pertence ao clado Epiatta e indica, para ambos os clados, Epiatta e Neoatta, um padrão interessante no qual espécies intimamente relacionadas apresentam ecologias diferentes. As idades muito jovens do gênero Atta e suas espécies representam uma radiação recente e rápida. Nossas análises biogeográficas sugerem que o ancestral comum do gênero Atta se originou na América do Norte e que uma linhagem filha, que posteriormente se dispersou na América do Sul, rapidamente se diversificou no bioma Cerrado recém-formado.
  • ItemTese de doutorado
    Efeito do alérgeno Poly p 5 do veneno de Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae) na modulação do fenótipo funcional de macrófagos intraperitoneais murinos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-05-03) Bazon, Murilo Luiz [UNESP]; Brochetto Braga, Márcia Regina [UNESP]; Simioni, Patrícia Ucelli [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A vespa social Polybia paulista (Hymenoptera, Vespidae), abundante no sudeste do Brasil, é extremamente agressiva, sendo responsável por diversas ocorrências médicas. Estudos com os componentes alergênicos deste veneno têm ganhado crescente interesse devido a resultados promissores de seu uso em diagnóstico laboratorial, bem como em protocolos clínicos de imunoterapia alérgeno específica. Dentre os componentes presentes no veneno de P. paulista, a proteína Antígeno 5 (Poly p 5) tem sido considerada um dos principais alérgenos presentes nessa espécie, que pertence à superfamília das proteínas secretoras ricas em cisteína (CAP). Apesar disso, sua função biológica como componente do veneno de Vespidae permanece desconhecida. Nesse contexto, foi analisada a possível modulação da resposta imune in vitro induzida pelo alérgeno Poly p 5, expresso na forma recombinante (rPoly p 5) em levedura Komagataella phaffi (Pichia pastoris), sobre macrófagos peritoneais extraídos de camundongos BALB/c, ativados e não ativados com estímulo pró- inflamatório (LPS). Para isto foram analisadas, nestas células, alterações de viabilidade celular, expressão da forma fosforilada de NF-κB, produção de óxido nítrico (NO) e de citocinas pró-inflamatórias, além da expressão das moléculas co- estimulatórias CD80 e CD86. Os resultados indicam que rPoly p 5, na concentração de 1 μg/mL, não afeta a produção de NO e não modula a expressão de moléculas co- estimulatórias CD80 e CD86 em macrófagos peritoneais de camundongos, ativados ou não com LPS. Entretanto, o rPoly p 5 induziu um aumento de IL-1 β (p=0,0463) em macrófagos não estimulados com LPS e uma redução na produção das citocinas TNF- α (p= 0,0297) e MCP-1 (p=0,040), quando estimulada com LPS. O alérgeno rPoly p 5 também diminuiu significativamente a produção in vitro do da forma fosforilada p65 de NF-κB (p=0,0463) em macrófagos, quando comparado ao grupo controle (sem LPS). A avaliação do potencial pró ou anti-inflamatório do alérgeno rPoly p 5, por meio da análise das respostas dos macrófagos intraperitoneais de camundongos, ainda não levou a uma compreensão clara do potencial imunomodulador desta proteína. Todavia, alguns achados podem indicar um papel importante deste alérgeno na polarização de fenótipos funcionais de macrófagos M2.
  • ItemTese de doutorado
    Toxicidade de efluentes de Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) antes e após desinfecção por processos oxidativos avançados
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-04-09) Sommaggio, Lais Roberta Deroldo [UNESP]; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Mazzeo, Dânia Elisa Christofoletti [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O desenvolvimento de novas tecnologias para o tratamento de águas residuais em Estações de Tratamento de Esgoto (ETE) são fundamentais para a minimização da poluição dos recursos hídricos. Dentre as novas tecnologias, destacam-se os Processos Oxidativos Avançados (POAs), como a ozonização e a radiação ultravioleta (UV) associada ao peróxido de hidrogênio (H2O2). Esses processos baseiam-se na utilização de espécies altamente oxidantes, para promover a degradação mais efetiva de poluentes e a desinfecção de microrganismos patogênicos dos efluentes. A eficácia dos tratamentos de efluentes também é essencial para um reaproveitamento seguro dessas águas (reuso). Contudo, os POAs podem gerar compostos tóxicos que inviabilizam a reutilização das águas e comprometem o corpo d´água receptor. Nesse sentido, os ensaios realizados com indicadores biológicos de alta performance são ferramentas importantes para serem empregados na avaliação e certificação da isenção de toxicidade de efluentes submetidos a processos de tratamentos avançados. Além de medir o poder desinfetante do sistema utilizado, é necessário também monitorar os possíveis impactos ambientais que esses processos possam causar. Amostras de efluentes de duas ETEs da cidade de Limeira, de características distintas (ETE Municipal e ETE Unicamp) e coletados sazonalmente (período chuvoso e seco), foram submetidas aos tratamentos com ozônio ou com UV/H2O2, por períodos de 20 (T1) e 40 (T2) minutos. Diferentes bioensaios foram utilizados para a avaliação das amostras, antes da aplicação dos POAs e após esses tratamentos. A fitotoxicidade das amostras foi avaliada por ensaios de germinação e elongamento do hipocótilo e radícula em Lactuca sativa. Os ensaios de genotoxicidade (Cometa e Micronúcleo) foram realizados em cultura de células humanas HepG2/C3A. Ainda, foram avaliados os potenciais mutagênicos e estrogênicos dos extratos das amostras, pelo ensaio de Salmonella/microssoma e leveduras recombinantes (YES), respectivamente. Além disso, foi realizada uma caracterização microbiológica para avaliar os microrganismos persistentes no efluente final das ETEs. Os resultados da análise microbiológica mostraram que o maior tempo de ozonização e o tratamento com UV/H2O2 foram eficientes para a desinfeção do efluente do indicador Escherichia coli. O tratamento coma UV/ H2O2 foi mais eficiente na desinfecção da maioria dos microrganismos que o tratamento com ozônio. Bacillus sp. foi o microrganismo mais resistente identificado, já que foi encontrado mesmo após o maior tempo de reação (T2) dos tratamentos de O3 e UV/H2O2. Os resultados com Lactuca sativa mostraram inibição do crescimento da raiz, para todas as amostras da ETE Municipal-período seco. Os resultados do ensaio do cometa mostraram que as amostras da ETE Municipal-período seco, submetidas ao tratamento de UV/H2O2 (T1 e T2), induziram efeitos genotóxicos significativos em células HepG2/C3A, quando comparados ao controle negativo (CN). Com relação ao ensaio do MN, foi observado uma indução significativa desses elementos, em todos os tratamentos da ETE Unicamp e da ETE Municipal-período seco, quando comparados ao CN. A presença de brotos nucleares foi significativa para todos os tratamentos realizado da ETE Unicamp e para os tratamentos com UV/H2O2 da ETE Municipal-período seco. A presença de mais de uma alteração por célula (alterações compostas– ex. MN e broto nuclear, MN e ponte, entre outras) foi significativa para o tratamento com UV/H2O2 (T1) da ETE Municipal-período seco, quando comparado ao CN. A avaliação do total das alterações (somatória de todos os eventos) foi significativa para todos os tratamentos da ETE Unicamp; tratamentos com UV/H2O2 (T 1 e T2) da ETE Municipal-período seco; e para as amostras de efluente, antes da aplicação dos POAs, O3T2 e UV/H2O2 T2 da ETE Municipal-período chuvoso. Foram observadas atividades estrogênicas para a maioria dos efluentes coletados antes da aplicação dos POA e para os efluentes coletados após o tratamento com UV/H2O2. Os efluentes submetidos a ozonização não demonstraram tal atividade. Com relação ao ensaio com Salmonella, foi observado potencial mutagênico para as linhagens TA98 e TA100, com ativação metabólica, nas amostras tratadas com UV/H2O2. Frente ao exposto, foi observado que o tratamento com UV/H2O2 apresentou um maior poder de desinfecção das amostras, mas também um maior efeito tóxico, quando comparado com o tratamento com O3. Dessa forma, os tratamentos que utilizam POAs devem levar em consideração não somente o poder desinfetante do tratamento, mas os possíveis impactos que os mesmos possam causar ao ambiente e à saúde humana.
  • ItemTese de doutorado
    Análise dos efeitos do fungicida piraclostrobina e do inseticida acetamiprida em abelhas eussociais (Hymenoptera: Apidae)
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2021-03-03) Domingues, Caio Eduardo da Costa; Malaspina, Osmar [UNESP]; Silva-Zacarin, Elaine Cristina Mathias da; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    As abelhas são essenciais na preservação de ecossistemas e muito importantes na agricultura, tendo em conta a relevância dos serviços ecossistêmicos de polinização prestados por estes insetos. A espécie Apis mellifera é a principal polinizadora em culturas agrícolas, proporcionando benefícios na qualidade e quantidade da produção de muitas espécies utilizadas na alimentação humana. Em contrapartida, a espécie nativa sem ferrão Melipona scutellaris é vital para a manutenção da flora nativa. No entanto, o uso de agrotóxicos associado à fragmentação de habitats e agricultura intensiva são uma ameaça às populações dessas espécies de abelhas. Tendo isso em vista, o presente estudo teve por objetivo avaliar os efeitos biológicos do fungicida piraclostrobina, em escala individual e subindividual, de larvas, recém-emergidas e forrageiras de A. mellifera Africanizada e forrageiras de M. scutellaris, bem como avaliar o desenvolvimento de colônias de A. mellifera iberiensis antes e após exposição ao inseticida acetamiprida em plantações de eucaliptos em Portugal. Na primeira parte da pesquisa, conduzida em laboratório, larvas de A. mellifera Africanizada receberam dieta artificial, in vitro, contendo três concentrações de piraclostrobina [911,25 ng/mL; 94,06 ng/mL e 30,25 ng/mL], do terceiro ao sexto dia de alimentação. Após a exposição, larvas de quinto instar e recém-emergidas foram dissecadas, processadas histologicamente para avaliação imuno-histoquímica por meio do diagnóstico de morte celular no epitélio do intestino e marcação de quitina na matriz peritrófica. Efeitos prejudiciais no desenvolvimento pós-embrionário não foram observados. Entretanto, as concentrações mais altas de piraclostrobina induziram lesões no intestino, como morte celular, e aumento na intensidade de marcação de quitina na matriz peritrófica das larvas e recém-emergidas. Na segunda parte da pesquisa laboratorial, abelhas recém-emergidas e forrageiras de A. mellifera Africanizada e M. scutellaris foram submetidas a exposição oral por cinco dias, a três concentrações residuais de piraclostrobina [0,125 ng i.a./mL; 0,025 ng i.a./mL e 0,005 ng i.a./mL]. Os parâmetros observados foram tempo de sobrevivência dos adultos, análises morfológicas, qualitativas e semiquantitativas, e histoquímicas. Os resultados demonstraram redução da longevidade, aumento nos índices totais de lesões e diminuição na intensidade de marcação de macromoléculas como proteínas, polissacarídeos neutros e glicoconjugados, no intestino médio das forrageiras de A. mellifera e M. scutellaris. As operárias recém-emergidas de A. mellifera não apresentaram redução da sobrevivência e lesões no intestino médio, contudo, houve redução de intensidade de marcação para polissacarídeos neutros e glicoconjugados. Como consequência da exposição ao piraclostrobina, a saúde individual de ambas as espécies foi afetada e isso pode comprometer e prejudicar a manutenção da saúde da colônia. Nesse sentido, estudos com concentrações residuais de fungicidas presentes no alimento e os seus efeitos em diferentes espécies de abelhas são relevantes para estimar a sensibilidade interespecífica e subsidiar futuros programas de avaliação de risco das abelhas. Em relação à pesquisa conduzida em Portugal, duas janelas de estudo foram selecionadas em paisagens dominadas por eucaliptos. No centro de cada local foi instalado um apiário, sendo definidos como apiário controle e apiário com aplicação pontual de acetamiprida. O monitoramento foi realizado durante seis meses, onde a saúde e o desenvolvimento das colônias, bem como a distância de forrageamento, presença de resíduos de agrotóxicos e a utilização de recursos nas paisagens foram avaliadas. Os resultados demonstraram que não houve diferença no desenvolvimento das colônias, observados por meio da população adulta, células de ninho e produção de mel entre os locais, antes e após exposição ao inseticida. A distância de forrageamento das colônias do apiário aplicação indicaram que menos de 4% entraram em contato com o raio da aplicação pontual. A coleta de recursos pelas colônias demonstrou-se mais intensa antes da aplicação de acetamiprida, com destaque para as espécies da vegetação arbustiva e subarbustiva. Apesar disso, resíduos de acetamiprida foram detectados em amostras de pólen e bee bread. Diante do exposto, o período de aplicação do inseticida não foi prejudicial para as colônias, contudo, os resultados se aplicam as condições específicas do local estudado. Desta maneira, os parâmetros utilizados no monitoramento das colônias ofereceram informações importantes que podem contribuir para uma menor exposição das abelhas nas diferentes paisagens em que os agrotóxicos são utilizados.
  • ItemTese de doutorado
    Diversidade de microrganismos endofíticos associados a folhas de oliveiras e sua relação anti-herbivoria por formigas-cortadeiras
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-12-03) Oliveira, Amanda Aparecida de; Bueno, Odair Correa [UNESP]; Harakava, Ricardo; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Nas últimas décadas no país, a olivicultura tem se expandido na região sudeste principalmente nos estados como São Paulo e Minas Gerais, desafios com insetos pragas como as formigas-cortadeiras têm se mostrado um obstáculo para o cultivo. A oliveira (Olea europaea) é uma planta originária da região Mediterrânea e tem se mostrado altamente atrativa ao corte por formigas-cortadeiras, essa que por sua vez têm origem nos neotrópicos. Em busca de métodos de controles alternativo para formigas-cortadeiras, pesquisas com microrganismos para esse uso têm ganhado destaques nos últimos anos. Os microrganismos endofíticos são principalmente fungos e bactérias que vivem dentro do tecido foliar sem causar danos aparentes ao hospedeiro. Pesquisas sobre abundância de endófitos mostrou que esse parâmetro além de idade e tenacidade da folha deveriam ser considerados sobre escolha de corte. Para a cultura da oliveira não se sabe se cultivares diferentes influenciariam na escolha do corte das formigas-cortadeiras. Os endofíticos podem desempenhar inúmeros benefícios às plantas hospedeiras como promoção de crescimento, resistência a estresse abióticos e proteção anti-herbivoria. Por isso, conhecer a diversidade de microrganismos endofíticos associados a folhas de oliveiras é um primeiro passo para compreensão dessa interação entre as formigas-cortadeiras e essa planta introduzida. Ferramentas moleculares são frequentemente utilizadas para conhecer diversidade de endofíticos combinando técnicas de isolamento e de sequenciamento de nova geração (NGS). Assim, os objetivos deste estudo foram identificar a diversidade de microrganismos endofíticos associados às folhas de oliveira com métodos dependente e independente de cultura, verificar quais fatores influenciam a composição e abundância dessa comunidade microbiana, realizar isolamento de fungos endofíticos, identificá-los molecularmente, identificar o modo trófico desses fungos pelo FunGuild e verificar a preferência de corte das formigas-cortadeiras entre as cultivares de oliveiras. Amostras de folhas foram coletadas de 93 plantas em nove localidades dos estados de São Paulo e Minas Gerais. Uma parte foi utilizada para extrair diretamente o DNA e a outra para realizar o isolamento dos fungos. Para o sequenciamento metabarcoding pelo equipamento MiSeq (Illumina) foram utilizados primers para as regiões 16S rRNA para identificar bactérias e ITS para fungos. Para os fungos cultiváveis utilizou-se sequenciamento Sanger da região ITS. Os resultados revelaram que fatores como idade, altitude e geografia podem influenciar a comunidade microbiana, enquanto que a cultivar não influenciou. Para a comunidade bacteriana endofítica o fator que influenciou foi a localização geográfica e para a comunidade fúngica foram idade, altitude e localização. Foram obtidos cerca de 800 isolados, que foram agrupados em 191 morfotipos e identificados molecularmente, resultando em 38 gêneros, sendo 32 deles registrados pela primeira vez em oliveiras cultivadas no Brasil. Entre os fungos cultiváveis o nível trófico mais abundante foi o patotrófico. As cultivares não influenciaram no corte pelas formigas-cortadeiras. Outros estudos serão necessários para melhor compreender como esses herbívoros apresentam uma capacidade de desfolhar plantas não-nativas como as oliveiras. Os isolados fúngicos obtidos serão utilizados para novas abordagens em diferentes áreas do conhecimento como fitopatologia e controle de insetos.
  • ItemTese de doutorado
    Bactérias do abdômen de formigas cortadeiras (Subtribo Attina): cultivo, sequenciamento e fisiologia
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-12-16) Zani, Renata de Oliveira Aquino; Bacci Junior, Maurício [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Interações entre insetos e microrganismos são comuns na natureza. As formigas pertencentes à tribo Attini interagem com uma complexa comunidade de microrganismos, alguns mediando a nutrição das formigas, outros causando infecções e outros protegendo as formigas de tais infecções. Além do fungo basidiomiceto mutualístico obrigatório que medeia a nutrição das formigas, procariotos Diazotróficos das Ordens Enterobacteriales presentes no jardim de fungos e Rhizobiales intestinais foram propostos por mediar a incorporação de nitrogênio atmosférico em proteínas de formigas. Entomoplasmatales também foram propostos para alimentar o metabolismo energético das formigas com acetato. Assim, as cortadoras de folhas parecem depender de uma comunidade microbiana para acessar os carbonos e o nitrogênio necessários à produção de milhões de indivíduos encontrados em uma única colônia. No presente trabalho, utilizamos técnicas independentes de cultivo assim como isolamento em meios de cultura para analisar microrganismos presentes nos abdomens de formigas do gênero Atta e Acromyrmex. Para abordagem independente de cultivo analisamos a classificação taxonômica dos amplicons gerados pelo sequenciamento de nova geração (NGS) das regiões V3 e V4 do gene ribossomal 16S bacteriano, que revelaram a diversidade na composição das comunidades bacterianas. Já em cultura encontramos três novos candidatos a parceiros, isolando frequentemente Rhizobiales, Burkholderiales e Pseudomonadales fixadores de nitrogênio quase idênticos do abdômen de diferentes gêneros e espécies de formigas cortadeiras. Esses isolados continham o gene nif e apresentaram capacidade de crescer em meios de cultivo a partir de nitrogênio molecular. Esses resultados apontam para múltiplas estratégias de nutrição de formigas para acessar o nitrogênio atmosférico. Este estudo destaca a importância das comunidades bacterianas associadas a formigas e fornece bases para estudos futuros sobre processos ecológicos que impulsionam o sucesso de formigas cultivadoras de fungos.
  • ItemTese de doutorado
    Estudo citogenético de dois grupos de anuros brasileiros (Anura – Amphibia) envolvidos em problemáticas taxonômicas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2020-02-19) Cholak, Luiza Rieder; Pasquali-Maltempi, Patrícia Parise [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os anfíbios anuros correspondem ao segundo grupo de vertebrados com maior número de espécies, perdendo apenas para os peixes. Só no Brasil são mais de 1000 espécies descritas, com novas descrições e revalidações acontecendo todo ano. Esse grupo está envolvido em diversas problemáticas taxonômicas, em parte por ser altamente polimórfico e ao mesmo tempo conter muitas espécies crípticas, em parte por ainda haver muitas lacunas no conhecimento acerca desse grupo, dado o tamanho da sua diversidade. Resolver problemáticas envolvendo esse grupo de vertebrados é fundamental para melhor estimar o tamanho real dessa diversidade, entender os caminhos evolutivos e as relações filogenéticas no grupo e poder auxiliar na conservação das espécies, traçando planos de manejo adequados, já que o declínio de anfíbios devido à perda e fragmentação de habitat, contaminação de ambientes naturais e disseminação de doenças tem aumentado vertiginosamente. Para isso, a taxonomia moderna conta com a soma de diferentes informações a respeito dos grupos, além dos dados morfológicos já tradicionalmente utilizados. Uma das áreas que tem se mostrado promissora como uma ferramenta de auxílio na taxonomia é a citogenética, especialmente depois do advento da citogenômica, além da sua importância para o entendimento da evolução cromossômica dos grupos. No entanto, trabalhos citogenéticos, especialmente aqueles aliados à biologia molecular, são escassos em anuros. Seguindo essa linha, esse trabalho buscou obter marcadores moleculares que pudessem auxiliar no esclarecimento de questões taxonômicas acerca de dois grupos de anuros endêmicos do Brasil, Thoropa Cope, 1865 e Haddadus binotatus (Spix, 1824). Para isso foram utilizados marcadores convencionais e moleculares, além de análises citogenômicas, com o auxílio de programas de bioinformática.
  • ItemTese de doutorado
    Histórico da aplicação de vinhaça em canaviais: bioensaios de toxicidade terrestre e aquática
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-12-29) Correia, Jorge Evangelista [UNESP]; Christofoletti, Carmem Silvia Fontanetti [UNESP]; Miranda, Jarbas Honorio de; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A vinhaça, um dos principais resíduos gerados na transformação da cana-de-açúcar em etanol, possui potencial poluidor, frente ao alto volume produzido e por suas características físico-químicas. A contaminação de lagos e rios, por infiltração de resíduos dispostos no solo, como a vinhaça e fertilizantes, por exemplo, merece destaque. Desde a proibição do descarte da vinhaça em água na década de 80, começou-se a utilizar esse resíduo como fertilizante nas culturas canavieiras. Atualmente, essa prática irá completar 40 anos e apenas em 2006 entrou em vigor uma legislação regulamentando a fertirrigação pela vinhaça. O potencial tóxico da vinhaça, tanto no solo como na água, vendo sendo comprovado por diversos estudos na última década, porém estudos que relacionem o tempo de seu em solo com a toxicidade se fazem necessários. Tendo isso em vista, esse estudo objetivou entender se os anos de fertirrigação de vinhaça altera a toxicidade no solo, a dinâmica do íon potássio no solo e a toxicidade do lixiviado da vinhaça que podem atingir as águas subterrâneas. Para isso, solos de culturas canavieiras fertirrigadas com vinhaça por 5, 15 e 30 anos foram coletados para realização do bioensaio de toxicidade terrestre e estudos de física de solo. O bioensaio de toxicidade terrestre foi realizado em triplicata expondo diplópodos da espécie Rinochricus padbergi por 21 e 42 dias. Após a exposição, três indivíduos de cada terrário foram anestesiados e dissecados para remoção do intestino médio para análise histopatológica e marcação de HSP70. Os solos apresentaram concentrações variadas de componentes orgânicos e metais. Após 21 dias, apenas três indivíduos sobreviveram ao solo S30 e após 42 dias também foi observada alta mortalidade, no tratamento com solo S15. A análise histopatológica mostrou espessamento do bordo em escova das células epiteliais, sendo esta alteração estatisticamente significativa para indivíduos expostos aos solos S5 e S15 por 21 dias. A perda de adesão das células epiteliais foi estatisticamente significativa nos indivíduos expostos a S15 por 21 dias e S5 por 42 dias. A dinâmica do íon potássio foi investigada mediante a análise de seus parâmetros de transporte, obtidos pelo ajuste numérico das curvas de distribuição de efluentes (Breakthrough Curves, BTC) aplicando o código CFITIM dentro do software STANMOD (STudio of ANalytical MODels) e pelo modelo HYDRUS -1D. Nos ensaios em coluna segmentada a diferença entre o solo referência e os solos fertirrigados se deu na concentração de potássio nos anéis inferiores, sendo maior nos solos fertirrigados, indicando uma maior mobilidade do potássio nesses solos. Nos ensaios de BTCs, observou-se nas curvas das simulações que a concentração de potássio chegou a 100% dos valores de entrada para quase todas as triplicatas de todos os solos. O equilíbrio foi atingido mais rápido no solo S5 em relação ao solo referência e mais rápido ainda no S15. Em contrapartida, o solo S30 foi o que apresentou maior interação do íon potássio com o solo, confirmados por apresentar os maiores valores de coeficiente de retardamento (R) e coeficiente de distribuição, sendo estatisticamente significativos quando comparados entre eles. Após os ensaios de física de solo, o lixiviado obtido nas colunas BTCs foi testado em diluição de 5 %, em biosansaio de toxicidade aquática utilizando Oreochromis niloticus (Pisces) como bioindicador e incidência de eritrócitos micronucleados e alterações histológicas e quantificação de proteínas de estresse no fígado com biomarcadores. Os resultados mostraram ação genotóxica do lixiviado de vinhaça após passagem nos solos de 5 e 15 anos, demonstrado pela maior incidência de eritrócitos micronucleados, estatisticamente significativa quando comparados ao controle. Os micronúcleos foram formados possivelmente por ação aneugênica, uma vez que não houve ação clastogênica confirmada pelo ensaio do cometa. Os peixes expostos ao lixiviado do solo de 15 anos apresentaram índices de alterações estatisticamente significativos para perda de limite celular e aumento de vacúolos citoplasmáticos quando comparados ao controle. Todos os tratamentos apresentaram aumento de volume dos núcleos dos hepatócitos, sendo esta alteração estatisticamente significativa em relação ao controle. Não houve diferença na marcação de polissacarídeos neutros evidenciados pela técnica de PAS. Mesmo não sendo estatisticamente significativos, observou-se um padrão de atividade para todas as enzimas presentes nesse estudo. A atividade das enzimas foi maior no tratamento com lixiviado de vinhaça do solo de 15 anos e os menores valores no tratamento do lixiviado proveniente do solo de 30 anos. Analisando os resultados de forma holística, podemos inferir que ao longo dos anos de aplicação de vinhaça, o potencial tóxico no solo aumenta a medida dos anos de aplicação de vinhaça. Inversamente, a toxicidade para as águas subterrâneas diminuiu no lixiviado do solo de 30 anos, uma vez que a tendência é que cada vez mais, parte dos componentes da vinhaça, possam ficar mais retidos no solo devido ao acúmulo de matéria orgânica e de íons com cargas positivas como potássio e cálcio. Esse comportamento também levanta o alerta para a salinização do solo com o tempo, podendo a longo prazo, afetar a própria produção de cana-de-açúcar.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação toxicogenética de amostras ambientais de uma área de mineração de ouro (Paracatu-MG) contaminada com arsênio e outros metais
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-09-27) Corroqué, Nádia Aline [UNESP]; Marin-Morales, Maria Aparecida [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O crescente aumento das atividades antrópicas vem promovendo um aumento nos impactos causados ao meio ambiente. Dentre essas atividades humanas, a mineração, realizada no Brasil desde o século XVII e persistindo até os dias atuais, tem se destacado, quanto à sua potencialidade de causarem danos ambientais. O estado de Minas Gerais é um grande produtor de ouro e nele está localizado o município de Paracatu, onde se encontra a mina Morro do Ouro, que é considerada uma grande lavra a céu aberto, situada a poucos metros do perímetro urbano. Diante deste cenário, o presente estudo tem por objetivo avaliar a biodisponibilidade dos metais presentes nas amostras, as fontes poluidoras envolvidas com a contaminação desses metais e os riscos que esses metais promovem ao meio ambiente, por meio das análises químicas, extrações sequenciais e cálculos de Fator de Enriquecimento (EF), Índice de geoacumulução (Igeo) e Avaliação de Risco (RAC) e o potencial tóxico das amostras, por meio de bioensaios in vivo (Allium cepa e Lactuca sativa) e in vitro (cultura celular humana – HepG2/C3A). Para a avaliação do comprometimento dos rios que recebem influência da mineradora, foram coletadas amostras de água superficiais e de sedimentos de 3 regiões distintas: 1) jusante da mina Morro do Ouro, onde está localizado o município de Paracatu (P1, P2 e P3); 2) jusante da barragem de rejeitos da mina Morro do Ouro (P4, P5 e P6) e 3) rio de captação de água para abastecimento público de Paracatu (P7) e água de abastecimento fornecido pela ETA de Paracatu (P8). Também foram preparados dois extratos dos sedimentos coletados (solubilizado e lixiviado). Os resultados mostraram que essa região é altamente enriquecida com metais provenientes da própria constituição das rochas, no entanto, as atividades antrópicas, como as da mineradora, estão aumentando a biodisponibilização desses elementos no ambiente. Os bioensaios com A. cepa mostraram citotoxicidade e genotoxicidade para todas as amostras de água e genotoxicidade para todas as amostras de sedimento. Potencial mutagênico foi observado em algumas amostras de água (P2, P5 e P7) e sedimento (P2, P3 e P8), assim como citotoxicidade para sedimentos (P6 e P7). Para os bioensaios com L. sativa, nenhuma das amostras, nem de água, nem de sedimento, interferiram na taxa de germinação. Apenas as amostras do ponto P3 (solubilizado) induziram diminuição da germinação. Já para o desenvolvimento das sementes de L. sativa, as amostras de água induziram diminuição no crescimento de hipocótilo e da raiz (P1, P6 e P8) e as amostras de sedimento diminuição do crescimento de hipocótilo (P1, P2, P3 e P5). Para os extratos solubilizado e lixiviado, foi observado um aumento no crescimento de raiz, para os dois extratos do ponto P4, mas não houve alteração no crescimento do hipocótilo. Os ensaios de viabilidade celular com o corante Azul de Tripan, realizados com cultura celular HepG2/C3A, mostraram que as células foram mais sensíveis ao extrato solubilizado do que ao lixiviado. O ensaio do cometa, realizado pela exposição às amostras de água e sedimento (solubilizado), mostrou genotoxicidade apenas para o ponto P6 (solubilizado). A ausência de genotoxicidade nos demais pontos ocorreu, provavelmente, devido a um maior efeito citotóxico dessas amostras. O ensaio do MN com bloqueio de citocinese mostrou que todas as amostras de sedimento (solubilizado) foram genotóxicas, além de altamente citotóxicas, por ter elevados os índices de morte celular e de proliferação celular, enquanto mutagenicidade foi observada somente para as amostras dos pontos P2 e P3. Diante desses resultados, pode-se concluir que a mineração do Morro do Ouro possui alta potencialidade de causar danos aos ecossistemas dos corpos d’água e também aos humanos que vivem nessa área de estudo.