Teses - Genética - IBILCE

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  • ItemTese de doutorado
    Efeito da melatonina na modulação dos miRNAs envolvidos na angiogênese em câncer de mama
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2019-02-18) Lacerda, Jéssica Zani; Zuccari, Debora Aparecida Pires de Campos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer de mama apresenta alta incidência e alta taxa de mortalidade devido a rápida progressão tumoral e disseminação metastática que ocorrem com o incentivo da angiogênese. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNA mensageiro (RNAm) não codificantes que desempenham papel fundamental na regulação gênica. A desregulação dessas moléculas está relacionada com a iniciação e progressão de diferentes tipos tumorais humanos, incluindo o câncer de mama. Existem fortes evidências de miRNAs atuando como oncogenes e supressores tumorais, regulando o processo de angiogênese, crescimento tumoral e metástase. É neste cenário que a melatonina, hormônio secretado pela glândula pineal, vem ganhando destaque como potencial tratamento contra o câncer de mama por apresentar efeitos oncostáticos, antiangiogênicos, além de atuar na regulação da expressão de miRNAs. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o potencial valor terapêutico da melatonina na regulação do supressor tumoral miR148a-3p e relação com a progressão tumoral e angiogênese. Inicialmente, células tumorais de mama MDA-MB-231 foram cultivadas nas condições experimentais controle e tratamento com melatonina (1 mM). O PCR Array foi realizado para análise da expressão de 84 miRNAs relacionados com o câncer de mama e, após análise em banco de dados e literatura, o miR-148a-3p foi selecionado para validação. As células MDA-MB-231 foram cultivadas em quatro grupos experimentais: controle, tratamento com melatonina (1 mM), superexpressão do miR-148a-3p e controle do processo de superexpressão e, após, foi realizado PCR em tempo real para análise da expressão gênica do miR-148a-3p e seus alvos Receptor do fator de crescimento semelhante a insulina-tipo 1 (IGF-1R) e Fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF). Os níveis proteicos de IGF-1R e VEGF foram quantificados por imunocitoquímica e western blotting. Ensaios de migração e invasão celular foram realizados para avaliar a potencial capacidade das células tumorais sofrerem metástases. Por fim, células MDA-MB-231 foram implantadas no flanco de camundongos Balb-C nude atímicos para desenvolvimento tumoral, sendo divididos em dois grupos experimentais mantidos por 21 dias: controle e melatonina (40 mg/kg). Após a coleta dos tumores, foi realizada a análise da expressão gênica e proteica do miR-148a-3p, IGF-1R e VEGF. A análise da expressão dos miRNAs por PCR array revelou que a melatonina regulou a expressão de 24 miRNAs negativamente e 8 miRNAs positivamente. Além disso, a melatonina aumentou a expressão gênica do miR-148a-3p, diminuiu a expressão gênica e proteica de IGF1R e VEGF, e teve efeito inibitório na sobrevivência, migração e invasão celular. O modelo xenográfico mostrou que a melatonina aumentou a expressão do miR-148a3p e diminuiu a expressão gênica e proteica de IGF-1R e VEGF. Nossos resultados confirmam a ação da melatonina na regulação do miR-148a-3p e processo de angiogênese tumoral, além de desempenhar importante papel na progressão do tumor de mama, sendo crucial para o estabelecimento de novos protocolos terapêuticos.
  • ItemTese de doutorado
    Efeitos do metilfenidato sobre o sistema dopaminérgico, comportamento e estresse oxidativo em Oreochromis niloticus
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-10-26) Batalhão, Isabela Gertrudes; Almeida, Eduardo Alves de; Silva, Danilo Grunig Humberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A ocorrência de fármacos no meio aquático tem aumentado consideravelmente nas últimas décadas, causando efeitos bioquímicos, fisiológicos e comportamentais em organismos aquáticos. Geralmente, a poluição aquática por fármacos ocorre como consequência das estações de tratamento de águas residuais (ETAR) não serem projetadas para remover completamente esses compostos dos efluentes, que por fim têm como destino as águas superficiais. O metilfenidato (MF, princípio ativo do medicamento ritalina®) é um estimulante do sistema nervoso central, recomendado para pessoas com transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), age inibindo os transportadores de recaptação da dopamina (3,4-dihidroxi-feniletanamina; DA), afim de aumentar os níveis desse neurotransmissor na fenda sináptica. Estudos já detectaram em efluentes a presença do MF e seu metabólito, o ácido ritalínico, em concentrações de ng.L-1. Com isso, o presente trabalho avaliou os efeitos bioquímicos, moleculares e comportamentais que o MF, em concentrações ambientalmente relevantes, pode causar em machos de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus). Peixes machos foram expostos a 0, 20,100 e 200 ng.L-1 de MF por 5 dias. Foram avaliados os efeitos do MF no comportamento agressivo, no sistema dopaminérgico e serotoninérgico, além nos níveis de transcritos de carboxilesterase e dos receptores de dopamina e na atividade da carboxilesterase (CbE) no encéfalo das tilápias expostas à concentração de 20 e 100 ng.L-1 de MF. Além disso, avaliamos enzimas do sistema de defesa antioxidante, enzimas de biotransformação, níveis de peroxidação lipídica e atividade das esterases no fígado e nas brânquias dos peixes expostos a 20, 100 e 200 ng.L-1 de MF. Os resultados mostraram que embora o MF aumente a agressividade dos animais, este efeito parece não estar diretamente relacionado ao sistema dopaminérgico dos animais, dada a diminuição das concentrações de DA e a ausência de alterações nos níveis de transcrição dos receptores de dopamina e tirosina hidroxilase. Também não foi relacionado a alterações nos níveis plasmáticos de testosterona. Sugerimos que o aumento da agressividade pode ser uma consequência de uma diminuição significativa nos níveis de 5-HT e DA no cérebro, diminuindo o medo e aumentando a ansiedade dos animais. Os resultados também mostraram que o efeito da exposição ao MF foi mais expressivo nas brânquias do que no fígado das tilápias. Foi observado uma diminuição concentração-dependente tanto na atividade das enzimas antioxidantes como na atividade das acetilcolinesterase nas brânquias dos animais, o que pode ter deixado os animais mais suscetíveis ao estresse oxidativo e a efeitos de hiperestimulação do SNC, respectivamente. Observarmos também, uma possível metabolização do fármaco devido ao aumento da CbE nas brânquias dos animais, porém, não houve alterações nas enzimas de biotransformação. A diminuição na peroxidação lipídica no fígado reforça a ausência de indução do sistema antioxidante mediante ao fármaco. Dessa forma, com o aumento do consumo global de diferentes classes de fármacos e a remoção incompleta desses compostos por ETAR, nossos resultados reforçam a importância de estudos que avaliem os riscos que os fármacos, em concentrações ambientalmente realísticas, podem causar em organismos não alvo, assim como, a importância de uma melhor eficiência na remoção dos fármacos pelos processos convencionais de tratamento dos efluentes.
  • ItemTese de doutorado
    Análise do padrão de metilação do gene SOX17 e expressão de microRNAs ao diagnóstico de síndrome mielodisplásica e citopenia Idiopática de significado indeterminado
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-05-07) Monteiro, Fernanda de Souza; Fett-Conte, Agnes Cristina; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Síndromes Mielodisplásicas (SMDs) é a denominação de um grupo de doenças neoplásicas clonais das células hematopoéticas, mais frequentemente observadas em idosos, caracterizadas por citopenias, displasia, hematopoese ineficaz e risco elevado para leucemia mielóide aguda (LMA). Citopenia(s) persistente(s), por mais de seis meses, e ausência de critérios diagnósticos para SMD, caracteriza a Citopenia Idiopática de Significado Indeterminado (ICUS). ICUS foi definida recentemente e é pouco conhecida quanto aos fatores etiológicos. Já as SMDs são consideradas protótipos de doenças epigenéticas, uma vez que distúrbios na metilação de alguns genes que regulam proliferação e diferenciação celular têm sido considerados fatores causais. O gene SOX17, por exemplo, é um supressor de tumor expresso em vários tecidos e alterações no seu padrão de metilação já foram observadas em tumores sólidos e neoplasias hematológicas, entretanto, foram pouco estudadas nas SMDs e não há descrições de estudos em ICUS. Do mesmo modo, alguns microRNAs vem sendo utilizados como marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico para diversas anormalidades hematológicas, mas seu papel na etiologia e desenvolvimento das SMDs também é pouco conhecido. Neste contexto, este estudo propos investigar o padrão de metilação do gene SOX17 por MSP-PCR em células da medula óssea (MO) de pacientes com SMD e ICUS ao diagnóstico, e analisar alterações no padrão de expressão de microRNAs por RT-PCR em células da MO de adultos e de crianças com SMD. Em adultos foram investigados os microRNAs miR126, miR29a, miR20a, miR181a, miR19b, miR21, miR155, miR146, miR22, miR193, miR26a e miR29b, e em crianças, os microRNAs miR193, miR29b miR22 e miR26a. O padrão de metilação do gene SOX17 foi analisado em 26 pacientes com SMD e em 15 pacientes com ICUS. A hipermetilação da região promotora do gene foi identificada em 57,7% dos indivíduos com SMD e em 53,3% daqueles com ICUS, sugerindo que o silenciamento do SOX17 pode ser um evento frequente e participar do curso inicial destas doenças. A análise dos microRNAs foi realizada em 55 pacientes adultos com SMD e em oito controles saudáveis. Dos 12 microRNAs testados, sete apresentaram padrão de expressão anormal em relação ao grupo controle, e dos quatro micros investigados em 28 pacientes com SMD infantil, os micros, miR193, miR29b apresentaram expressão diminuída em relação ao grupo controle em aproximadamente 70% dos pacientes analisados e a expressão do miR22 foi maior em mais da metade das amostras analisadas, enquanto uma expressão diminuída do miR26a foi observada em 28 (100%) dos pacientes analisados. Considerando-se que os microRNAs estudados podem atuar como reguladores da hematopoese, os dados revelam a importância dos microRNAS na etiologia das SMDs, sugerindo esses como possíveis biomarcadores diagnósticos para a SMD adulto e infantil.
  • ItemTese de doutorado
    Estudo dos mecanismos de ação do peptídeo Ac2-26 e da Piplartina nas células endoteliais de veias umbilicais humanas (HUVEC) ativadas pelo lipopolissacarídeo
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-06-21) Carvalho, Caroline de Freitas Zanon de; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os avanços recentes nos mecanismos de inflamação e a descoberta de vários mediadores endógenos anti-inflamatórios levaram a novas investigações sobre as possibilidades terapêuticas. A demonstração, em estudos científicos, da ação anti-inflamatória da proteína anexina A1 (ANXA1) e do seu peptídeo mimético Ac2-26, têm sido fonte de sucesso para o desenvolvimento de novos fármacos. A descoberta da interação biofísica da piplartina (PL) com a região N-terminal da ANXA1 abriu um novo e instigante campo de investigação para o nosso grupo de pesquisa. Diante destas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a atuação da PL nas células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC), ativadas pelo lipopolissacarídeo (LPS). Ainda, se a interação Ac2-26/PL influência nas ações anti-inflamatórias da PL, favorecendo ou atenuando os seus efeitos nos processos inflamatórios. Inicialmente foi utilizada a Espectroscopia de Absorbância UV-Vis e de Fluorescência para investigar as interações entre o ligante PL e Ac2-26. In vitro, as células HUVEC foram ativadas pelo LPS (10 μg/mL), nos tempos de 8, 24, 48 e 72 horas, seguido pelos tratamentos com Ac2-26 (1µM) e/ou PL (10µM), demonstrando resultados expressivos em 24 e 72 horas. Os efeitos foram avaliados nos seguintes aspectos: proliferação celular, viabilidade celular, dosagens da quimiocina MCP-1 e das citocinas IL-8 e IL-1β e expressão da proteína α-tubulina. A presença de um anel trimetoxiaromático na estrutura da PL, o que pode favorecer uma interação com a tubulina, motivou as análises de Western blotting, as quais demonstraram que a PL inibiu a síntese da proteína endógena α-tubulina, em todas as condições experimentais. Nossos resultados mostraram efeitos pró-proliferativos do peptídeo Ac2-26 e, por outro lado, antiproliferativos e pró-apoptóticos da PL. Os níveis das citocinas pró-inflamatórias confirmaram o papel anti-inflamatório do Ac2-26 nas células ativadas pelo LPS, com redução dos níveis de MCP-1 e IL-8, em 24 horas. O tratamento PL reduziu os níveis de MCP-1 nas células ativadas pelo LPS, e aumentou IL-8, inclusive no tratamento associado Ac2-26/PL. Em conjunto, os resultados com as células HUVEC indicam que a PL inibe a proliferação por meio da ativação da apoptose celular, regulada pela inibição da polimerização da α-tubulina e dos níveis elevados da citocina IL-8. A PL e o Ac2-26 mostraram ações anti-inflamatórias, e a interação Ac2-26/PL parece ser neutra em relação às propriedades anti-inflamatórias da PL.
  • ItemTese de doutorado
    Integrando diferentes abordagens genéticas para a compreensão dos cupins: delimitação de espécies do Grupo Nasutitermes jaraguae (Holmgren, 1910) (Isoptera: Termitidae: Nasutitermitinae), filogeografia da espécie N. jaraguae no bioma Mata Atlântica e filogenia das espécies do gênero Nasutitermes Dudley, 1890
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-03-09) Barbosa, Nara Cristina Chiarini Pena; Morales-Corrêa e Castro, Adriana Coletto [UNESP]; Madi-Ravazzi, Lilian [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O gênero Nasutitermes contém 257 espécies descritas, sendo considerado o gênero com a maior riqueza de espécies e a maior distribuição geográfica, entretanto, sua taxonomia ainda é bastante confusa. Este gênero é apontado como dominante no bioma Mata Atlântica e possui várias espécies que se distribuem por toda a região, como a espécie Nasutitermes jaraguae, a qual é morfologicamente muito semelhante a outras espécies que ocorrem nas mesmas localidades. Dessa forma, este trabalho teve como objetivos diferenciar, por meio de ferramentas moleculares, espécies do Grupo N. jaraguae; definir os processos responsáveis pelo padrão de distribuição da variabilidade genética da espécie N. jaraguae e entender as relações filogenéticas e os processos de diversificação das espécies do gênero Nasutitermes. As análises de delimitação de espécies do Grupo N. jaraguae foram realizadas com o gene mitocondrial COII e mostraram que os caracteres morfológicos, diagnósticos para a identificação das espécies analisadas, tanto reuniram espécimes geneticamente distintos, como separaram espécimes geneticamente semelhantes. Este cenário reflete a discordância entre a separação de linhagens e os critérios utilizados para a delimitação de espécies por diferentes conceitos de espécies, bem como demonstra que estes podem representar a plasticidade fenotípica de uma mesma linhagem. Evidenciou-se sete unidades evolutivas distintas, as quais podem ser consideradas espécies com base nos conceitos filogenéticos e evolutivos de espécies. A análise filogeográfica de N. jaraguae, realizada com o gene COII, demonstrou a existência de três grupos haplotípicos bem estruturados, cujos haplótipos encontram-se geograficamente agrupados. A organização na distribuição geográfica dos haplogrupos pode ser explicada com base na hipótese de refúgios florestais do Plioceno-Pleistoceno, o que reforça o padrão de distribuição de espécies na Mata Atlântica observado para outros grupos biológicos, enquanto a distribuição dos haplótipos dentro dos haplogrupos pode ser explicada pela hipótese de gradientes ecológicos. As análises filogenéticas do gênero Nasutitermes foram realizadas com os genes COII, 16S rRNA e 12S rRNA e a região ITS2. Espécies com distribuição geográfica distante apareceram filogeneticamente relacionadas, indicando que a origem do gênero Nasutitermes é posterior a separação da Gondwana, com episódios de dispersão intercontinentais dentro do gênero, bem como eventos de especiação independentes nas regiões zoogeográficas. Foi possível ainda sugerir novas hipóteses sobre a diversificação de Nasutitermes e, dessa forma, compreender melhor a história evolutiva deste gênero.
  • ItemTese de doutorado
    Interação funcional e molecular da proteína anexina A1 e do quimioterápico cisplatina no carcinoma de colo de útero
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-06-05) Prates, Janesly; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Rodrigues-Lisoni, Flávia Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer de colo de útero apresenta altas taxas de incidência e mortalidade, e sua progressão depende de características genéticas e interações das células tumorais, epiteliais e inflamatórias. A maioria dos protocolos de tratamentos, neste tipo de câncer, utiliza a Cisplatina (Cis). No entanto, este quimioterápico induz efeitos colaterais, como a nefrotoxicidade, por isso alternativas terapêuticas tem sido estudadas, como a proteína anexina A1 (ANXA1), que apresenta ações anti-inflamatória, antiproliferativas e também modula a expressão do gene Inibidor de Diferenciação ao DNA 1 (ID1) no processo tumoral. Com essas considerações, o objetivo do trabalho foi investigar a interação molecular dos mediadores ANXA1 e ID1 com a Cis em linhagem celular, e relacionar com tecidos neoplásicos intraepiteliais no processo tumorigênico cervical. As células SiHa (carcinoma epidermóide de cérvice), tratadas com o peptídeo da anexina A1 (AC2-26), Cis e AC2-26+Cis, foram avaliadas nos ensaios de proliferação, citotoxicidade, migração celular, apoptose, imunolocalização e expressões dos genes ANXA1 e ID1, e das proteínas ANXA1, ID1 e ERK1/2 (Quinase Regulada Extracelularmente 1/2). As amostras de tecidos cervicais foram analisadas histopatologicamente e as expressões proteicas de ANXA1 e ID1, por imuno-histoquímica. Os tratamentos, em todos os grupos, diminuíram a proliferação e migração celular, sem efeitos citotóxicos. Enquanto, Cis e AC2-26+Cis induziram as células aos processos de apoptose tardia, diminuição da expressão do ID1 e aumento da ANXA1, indicando a atividade antineoplásica da cisplatina. A administração Cis e AC2-26+Cis inativou ERK1/2 fosforilada e induziu a translocação nuclear da ANXA1. As expressões das proteínas ID1 e ANXA1 foram observadas nas amostras teciduais de Neoplasias Intraepiteliais Cervicais (NIC), com intensa imunomarcação de ID1 em NIC III. Em conjunto, os dados obtidos nesse trabalho fornecem entendimento adicional do mecanismo de ação da cisplatina na modulação dos mediadores ID1 e ANXA1 no processo tumorigênico. Esses achados podem delinear novas estratégias para a intervenção terapêutica no câncer de colo de útero.
  • ItemTese de doutorado
    Análise morfológica, imuno-histoquímica e ultraestrutural dos efeitos da exposição ao flavonóide crisina sobre a próstata de gerbilos adultos
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-02-23) Campos, Mônica Sousa; Taboga, Sebastião Roberto [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A crisina é um composto natural biologicamente ativo encontrado predominantemente em flores de maracujá azul, em mel, camomila, própolis e casca de frutas. Possui propriedades potentes como efeito anti-inflamatório, antioxidante e tem sido empregada para o tratamento de desordens reprodutivas. Essa flavona tem o potencial de aumentar os níveis de testosterona endógena, tanto por inibir a enzima aromatase, quanto por estimular a esteroidogênese testicular. Alterações no metabolismo hormonal mediadas por interferências exógenas podem interferir na fisiologia prostática resultando em modificações na atividade secretora da glândula e na regulação dos receptores hormonais. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da exposição à crisina sobre a próstata e gônadas de gerbilos adultos. Para avaliar o potencial androgênico da crisina, nós analisamos, comparativamente, os efeitos da testosterona sobre estes mesmos órgãos. Machos e fêmeas de gerbilos com 90 dias de idade foram tratados com crisina (50 mg/kg/dia) ou com cipionato de testosterona (1 mg/kg/semana) e divididos tem 3 subgrupos que foram eutanasiados após 3, 7 e 21 dias de tratamento. As próstatas foram coletadas para análises morfológicas, morfométrico-estereológicas, imuno-histoquímicas e ultraestruturais. Testículos e ovários foram submetidos a análises morfológicas e morfométrico-estereológicas. Os níveis séricos de testosterona e 17β-estradiol foram mensurados por ELISA. Machos e fêmeas tratados com crisina não apresentaram aumento dos níveis séricos de testosterona. No entanto, apenas as fêmeas tratadas com crisina durante 21 dias demonstraram aumento nos níveis séricos de estradiol. Foram observados tanto na próstata ventral masculina, quanto na próstata feminina em todos os tempos de tratamento com crisina, aumento da frequência de receptores androgênicos (AR), maior taxa de proliferação e hiperplasia glandular. Além disso, foi observada nas fêmeas em todos os tempos de exposição com crisina maior frequência imunomarcação para receptor estrogênico alfa (ERα). Ultraestruturalmente, machos e fêmeas tratados com crisina apresentaram intenso desenvolvimento das organelas da rota biossintética-secretora, acompanhada de intensa remodelação estromal, enquanto toxicidade celular foi observada apenas nas fêmeas. Nas gônadas masculinas o tratamento com crisina preservou a morfologia testicular. Em fêmeas, observou-se um maior número de folículos ovarianos em maturação. Comparativamente o tratamento com cipionato de testosterona foi capaz de causar lesões na próstata e gônadas, visto que focos de neoplasia intraepitelial prostática e degeneração gonadal foram observados em ambos os sexos. Esses resultados demonstram que a exposição à crisina, preservou a morfologia testicular normal, aumentou o número de folículos ovarianos em crescimento, aumentou a atividade secretória e alterou a regulação de receptores hormonais na próstata, potencializando a resposta desta glândula aos efeitos biológicos dos esteróides endógenos. Assim nas condições experimentais desse estudo embora a crisina e a testosterona evocassem alterações morfológicas semelhantes na próstata gerbilos masculina e feminina, a suplementação com crisina foi mais favorável à saúde da próstata. Contudo, a administração de crisina como agente fitoterápico deve ser considerada com precaução, visto que esse flavonóide parece exercer efeitos diferenciais em machos e fêmeas.
  • ItemTese de doutorado
    Estrutura populacional de Drosophila sturtevanti (subgrupo sturtevanti; grupo saltans) por meio de microssatélites espécie-específicos e biodiversidade de drosofilídeos em domínios da Mata Atlântica
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-02-28) Trava, Bruna Memari; Madi-Ravazzi, Lilian [UNESP]; Mateus, Rogério Pincela; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Drosophila sturtevanti é uma espécie neotropical com distribuição geográfica extensa que ocorre do México ao sul do Brasil e nas ilhas do Caribe. Na América do Sul é abundante e adaptada a diferentes fitofisionomias da Mata Atlântica. Estudos reprodutivos, cromossômicos, enzimáticos, moleculares e morfológicos indicam a existência de diferenciação entre suas populações. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o nível de diversidade genética e analisar a estrutura das populações de três regiões geográficas do Brasil em áreas da Mata Atlântica do Nordeste, Sudeste e Sul usando microssatélites espécie-específicos. No presente estudo, 126 machos de D. sturtevanti foram coletados em nove fragmentos da Mata Atlântica e analisados para 11 locos de microssatélites espécie-específicos. Um total de 109 alelos foram produzidos, variando de 2 a 16 alelos por loco, e a heterozigosidade média observada foi baixa (0,20 a 0,38). Houve uma diferenciação genética moderada (FST = 0,08) entre populações e alta deficiência heterozigótica. Não houve correlação entre distância genética e geográfica. Mais de 50% das populações apresentaram as frequências alélicas fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os marcadores microssatélites mostraram um polimorfismo considerável e riqueza alélica nas populações de D. sturtevanti, bem como uma estrutura populacional moderada que sugere evidência de fluxo gênico. A maior diferenciação da população de Ribeirão da Ilha, SC pode ser atribuída ao efeito de fundação e / ou ausência de fluxo gênico devido à sua posição geográfica isolada (uma ilha). Também foi detectada a presença de um gargalo genético na população de Guaribas, PB. No presente trabalho foi realizado também um estudo da biodiversidade de drosofilídeos em diferentes áreas de domínio da Mata Atlântica. Neste estudo, foi avaliada a composição faunística, abundância e riqueza das espécies de drosofilídeos de quatro remanescentes florestais do estado de São Paulo: Parque Estadual Serra da Cantareira (SDC), Parque Estadual Picinguaba (PIC), Matão (MAT) e Nova Granada (NGR). Para as coletas foram utilizadas 60 armadilhas fechadas distribuídas em seis transectos paralelos sentido borda-interior, contendo isca de banana e levedura. Todos os machos coletados e os machos F1 obtidos das isolinhagens de fêmeas crípticas foram identificados pela análise do edeago. No total, 19.685 indivíduos foram coletados e 5.886 machos foram identificados. Ao todo, foram identificadas 49 espécies de drosofilídeos (incluindo Zaprionus indianus e Scaptodrosophila latisfaciaerfomis). As áreas estudadas não diferiram significativamente em relação à abundância das espécies coletadas, no entanto, elas diferiram em riqueza de espécies. Um total de 30 espécies foram identificadas em Serra da Cantareira; 26 em Picinguaba; 24 em Matão e 17 em Nova Granada. As áreas da Serra da Cantareira e Picinguaba apresentam a maior extensão e preservação e foram as áreas com a maior abundância (72%) de D. willistoni, uma espécie característica de mata bem preservada, e 21 espécies foram exclusivas dessas áreas. Em contraste, as áreas de Matão e Nova Granada foram caracterizadas pela maior abundância de espécies invasoras, as quais indicam um menor grau de preservação. Esses resultados corroboram o uso da abundância de drosofilídeos em estudos de monitoramento e preservação ambiental.
  • ItemTese de doutorado
    Análise genética e molecular do ceratocone envolvendo os genes VSX1, SOD1, TIMP3 e LOX
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-03-06) Lopes, Alessandro Garcia; Castiglioni, Lilian; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O ceratocone é uma doença comum que acomete a córnea, afetando ambos os gêneros em todas as etnias e que pode se manifestar bilateralmente, de forma assimétrica. Por tratar-se de uma doença degenerativa, sua progressão pode ser rápida em diversas situações, acometendo 1 a cada 2.000 pessoas e resultando em severas alterações estruturais da córnea, as quais diminuem sua espessura e modificam sua curvatura normal para um formato mais cônico. O quadro clínico é composto por sintomas variados, destacando-se miopia e astigmatismo. Atualmente sabe-se que fatores genéticos e ambientais estão envolvidos no surgimento do ceratocone. Recentemente vários estudos genéticos têm como objetivo a identificação de mutações em genes que estejam diretamente ligados à doença, bem como seus papéis fisiológicos. Contudo, apesar dos esforços direcionados para o conhecimento dos aspectos genéticos, envolvendo diversos genes, ainda existem muitas dúvidas a respeito dos papéis destes na etiologia desta anomalia ocular. Assim, neste estudo, pretendeu-se identificar a presença de mutações e/ou polimorfismos nos genes VSX1, SOD1, TIMP3 e LOX, importantes candidatos à origem e desenvolvimento desta doença, a partir da análise pareada das sequências nucleotídicas de tecido da córnea e sangue periférico dos pacientes portadores desta patologia. As avaliações oftalmológicas incluíram exame clínico, topografia e tomografia. As amostras de DNA foram extraídas de sangue periférico e de fragmentos de córnea e as regiões codificantes dos genes foram amplificadas por reação em cadeia da polimerase (PCR), desnaturadas e submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida. Então, o rastreamento mutacional foi realizado através da técnica de SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) seguido de sequenciamento direto. A metodologia específica de pesquisa utilizando-se fragmentos de córnea, desenvolvida para este estudo, é algo inédito, diante dos trabalhos os quais utilizam apenas sangue. Alguns SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) foram detectados nas regiões codificantes dos genes VSX1, SOD1 e TIMP3, em ambos os tecidos, mas esses SNPs não promovem alterações patogênicas nas estruturas das proteínas codificadas por esses genes, correspondendo a apenas trocas sinônimas de aminoácidos. Quanto ao gene LOX, foi detectado a ausência de qualquer polimorfismo, tanto em gel como no sequenciamento. Em relação aos polimorfismos encontrados, eles estavam concordantes em ambos os tecidos analisados, córnea e sangue. A ausência de alterações patogênicas nestes genes, obtida por este estudo em população brasileira, aliada aos resultados obtidos em outros estudos envolvendo outras populações mundiais, os quais também não encontraram mutações nestes genes, sugerem que outros fatores genéticos possam estar implicados no surgimento do ceratocone, sendo importante ressaltar também os fatores ambientais e comportamentais envolvidos tais como atopia, ato de coçar os olhos, luz ultravioleta e o uso excessivo de lentes de contato.
  • ItemTese de doutorado
    Influência de marcadores de hipóxia e da síntese de óxido nítrico no processo hemolítico em anemia falciforme (Hb SS) e malária por Plasmodium vivax.
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-03-02) Nascimento, Patricia Pereira do; Bonini-Domingos, Claudia Regina [UNESP]; Machado, Ricardo Luiz Dantas; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A hemólise, processo caracterizado pela degradação de eritrócitos senescentes ou defeituosos, pode estabelecer-se de modo fisiopatológico em diferentes doenças. A ruptura do eritrócito com consequente liberação da hemoglobina (Hb) plasmática, desencadeia eventos como hipóxia e a diminuição da biodisponibilidade de óxido nítrico (NO), os quais influenciam no estabelecimento de manifestações clínicas em doenças hemolíticas. Apesar das distintas etiologias, o processo de hemólise está presente tanto entre os eventos fisiopatológicos da anemia falciforme (AF), uma anemia hemolítica caracterizada por hemólise crônica e fenótipos heterogêneos entre os indivíduos; quanto na malária por Plasmodium vivax (P. vivax), uma parasitose que apresenta, durante o ciclo intra-eritrocítico da doença, episódios de hemólise aguda. Assim, nosso objetivo foi avaliar a associação de marcadores bioquímicos e genéticos, envolvidos com as vias hemolíticas e da hipóxia, com o estabelecimento de diferentes perfis etiológicos de hemólise. Para isso, o grupo de estudo foi formado por indivíduos de ambos os gêneros, sendo 300 indivíduos com AF e 119 indivíduos com malária por P. vivax. O perfil hemolítico nesses indivíduos foi estabelecido por meio de parâmetros hematológicos e hemolíticos, comumente utilizados na rotina laboratorial. As relações entre os marcadores de hemólise, e desses com os níveis de hemoglobina plasmática (Hb plasmática), utilizada no estudo como marcador específico de hemólise intravascular, e com a proteína HIF1A, utilizada como marcador de hipóxia, foram também estabelecidas. Os marcadores genéticos foram investigados por meio da a associação entre o SNP rs7203560 do gene NPRL3, a VNTR rs61722009 (4a4b) e o SNP rs1799983 (894G>T) do gene eNOS, com o perfil hemolítico, além da associação do SNP rs11549465 (1772CT) do gene eNOS apresentou maior frequência genotípica e alélica, sendo o alelo (T) assim como o genótipo homozigoto mutante (TT), mais frequente entre os indivíduos com AF. Esse SNP também esteve relacionado com o perfil hemolítico em ambos os grupos de estudo, uma vez que os indivíduos com AF e malária, com genótipos GG e GT, apresentaram aproximadamente 1,3 vezes mais Hb plasmática. A mutação VNTR rs61722009 (4a4b), também do gene eNOS, esteve relacionada com o perfil hemolítico apenas nos indivíduos com AF, sendo níveis de Hb plasmática 1,2 vezes menores no grupo de indivíduos com genótipos homozigoto mutante (4b4b). Assim, as diferentes relações dos marcadores bioquímicos e genéticos, com o perfil hemolítico e hipóxico dos indivíduos com AF e malária por P. vivax, evidenciam que as diferentes etiologias hemolíticas das doenças, devem ser consideradas para a caracterização do processo de hemólise. Por fim, os marcadores bioquímicos laboratoriais de hemólise, comumente adotados na rotina laboratorial para a caracterização do perfil hemolítico desses indivíduos, demonstraram ser importante biomarcadores para essas doenças.
  • ItemTese de doutorado
    Efeito da proteína Galectina-1 em modelos experimentais de conjuntivite induzida pelo composto 48/80 ou ovalbumina em roedores
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2018-02-26) Mello, Claudia Bosnic; Gil, Cristiane Damas; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Introdução. A galectina-1 (Gal-1) é uma proteína de 14,5 kDa com afinidade aos ßgalactosídeos que contribui para a homeostase da inflamação, regulando o processo de transmigração dos leucócitos e liberação de citocinas. Contudo, o papel da Gal-1 em olhos normais e inflamados tem sido pouco estudados. Objetivo. Analisar o efeito do tratamento farmacológico com a Gal-1 recombinante (rGal-1) nos olhos de roedores utilizando dois modelos experimentais de conjuntivite. Métodos. Para o modelo de conjuntivite alérgica (CA), camundongos Balb/c machos foram imunizados via subcutânea com 5 μg de ovalbumina (OVA) nos dias 0 e 7. Nos dias 14-16, 0,3 μg/animal de Gal-1 foi instilado no saco conjuntival seguida, após 15 min, do desafio com 250 μg de OVA. Os animais SHAM (grupo controle) receberam soro fisiológico estéril. Após 4 e 24h do último desafio, os animais foram eutanasiados para coleta de sangue, olhos e pálpebras. Para o outro modelo de conjuntivite, ratos Wistar machos receberam no saco conjuntival do olho direito instilação do composto 48/80 (C48/80; 100 mg/mL), um secretagogo dos mastócitos. Como controle, o olho contralateral (esquerdo) foi instilado apenas com PBS. Outros ratos receberam em ambos os olhos instilação de 0,3 ou 3 µg/olho de Gal-1 ou 40 mg/mL de cromoglicato de sódio (SCG), e após 10 minutos, o C48/80 (olho direito) ou PBS (olho esquerdo - controle). Após 6h, os animais foram eutanasiados para coleta das pálpebras e olhos. Resultados. No modelo de CA, a instilação de Gal-1 diminuiu a proporção de mastócitos desgranulados e influxo de leucócitos na conjuntiva palpebral, assim como a produção de IFN-, em comparação com o grupo CA não tratado. A conjuntivite induzida pelo C48/80 provocou edema de pálpebras, conjuntiva e lacrimejamento, sinais clínicos reduzidos pela administração de Gal-1 (0,3 e 3 µg) e SCG. Corroborando esses achados, a administração do C48/80 aumentou a proporção de mastócitos desgranulados (62%, p < 0,01) e influxo de eosinófilos na conjuntiva palpebral em comparação com o controle (32%). Os tratamentos com Gal-1 (0,3 e 3 µg) e SCG reverteram esses efeitos, apresentando menor proporção de mastócitos desgranulados (31-36%) e eosinófilos, observações confirmadas pela presença de maiores níveis de histamina e peroxidase eosinofílica nos macerados dos olhos. Além disso, os tratamentos com Gal-1 (3 μg) e SCG diminuíram os níveis de IL-4, bem como a ativação das quinases ativadas por mitógenos (p38, ERK e JNK) em relação aos olhos ativados pelo C48/80 e não tratados. Conclusão. Nossos dados evidenciam que o tratamento farmacológico por instilação ocular de Gal-1 tem um potente efeito imunomodulador nos dois modelos de conjuntivite, indicando esta lectina como um importante alvo terapêutico na alergia ocular.
  • ItemTese de doutorado
    Papel da melatonina na modulação do miR-148b e miR-210 em linhagem triplo-negativa de mama
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-11-10) Ferreira, Lívia Carvalho [UNESP]; Zuccari, Debora Aparecida Pires de Campos; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer de mama apresenta altas taxas de incidência e também de mortalidade, sendo a neoplasia mais comum entre as mulheres. MicroRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas de RNAs não codificantes que desempenham papel fundamental na regulação gênica. Estudos recentes têm demonstrado que miRNAs estão diretamente envolvidos na iniciação e progressão de vários tipos tumorais, incluindo o câncer de mama. Diversos miRNAs têm sido descritos como promotores ou supressores tumorais, podendo estar associados ao crescimento do tumor e metástase. Atualmente, tem sido demonstrado que a administração exógena da melatonina, um hormônio naturalmente secretado pela glândula pineal, apresenta diversos efeitos oncostáticos em diferentes tipos tumorais. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o papel da melatonina em uma possível via metastática envolvendo a regulação de miRNAs em células da linhagem de câncer de mama metastática e triplo-negativa MDA-MB-231. Inicialmente, a expressão de 384 miRNAs foi avaliada utilizando placas “Taqman Low-density Array” (TLDA). Para futuras validações, foram selecionados apenas miRNAs que apresentaram fold change >1,5 e <0,5. Os resultados demonstraram que a melatonina modulou a expressão de 17 miRNAs (11 superexpressos e 6 inibidos). Dentre os miRNAs modulados pela melatonina, miR-148b e miR-210 foram confirmados por qRT-PCR, selecionados e utilizados para investigações funcionais. As células MDAMB-231 foram então transfectadas para inibição de miR-148b e/ou miR-210 (permanente ou transiente, respectivamente), e avaliadas após tratamento com melatonina. Em seguida foram avaliadas a taxa de migração e expressão proteica de cMyc, possível gene alvo de miR-148b e miR-210. Os resultados demonstraram que a melatonina foi capaz de reduzir a expressão de c-Myc e afetar a taxa de migração das células modificadas ou não com miR-148b. No entanto, nenhum efeito sobre c-Myc ou migração foi observado em células modificadas para miR-148b, quando comparadas as células controle. No que se refere ao miR-210, a melatonina alterou a expressão de cMyc e migração celular, nas células tratadas com melatonina ou expressando anti-miR210. Em resumo, nossos resultados demonstraram que apesar da melatonina influenciar na modulação positiva do miR-148b e miR-210 em células tumorais de mama triplonegativas, esta regulação não foi necessariamente causativa para alterar a expressão de c-Myc ou diminuir a taxa de migração destas células. Nossos resultados confirmam o efeito da melatonina na inibição da proliferação e migração celular, especialmente em células triplo-negativas, sugerindo seu importante papel no controle da progressão tumoral. No entanto, ainda é necessário estabelecer uma ligação direta entre as modulações de certas proteínas ou miRNAs com os efeitos da melatonina.
  • ItemTese de doutorado
    A melatonina e seus metabólitos como marcadores prognósticos em neoplasias mamárias humanas
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-10-31) Castro, Tialfi Bergamin de; Zuccari, Debora Aparecida Pires de Campos; Almeida, Eduardo Alves; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer de mama é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres e pesquisas têm sido focadas em identificar e validar biomarcadores que podem ser utilizados para confirmar o diagnóstico e determinar o prognóstico. Mudanças no ritmo circadiano podem contribuir para o desenvolvimento do câncer e sendo assim, a melatonina, um hormônio sintetizado pela glândula pineal à noite, na ausência de luz e seus metabolitos AFMK e AMK são sugeridos como potenciais biomarcadores. A melatonina pode atuar através do receptor MT1 regulando cinases e a expressão de genes específicos relacionados a proliferação, angiogênese, diferenciação celular e transporte de glicose. A expressão elevada de GLUT1 (Glucose Transporter-1) está associada ao prognóstico ruim no câncer. Os objetivos deste estudo foram comparar os níveis de melatonina, AFMK e AMK em mulheres recentemente diagnosticadas com câncer de mama, mulheres em quimioterapia adjuvante, enfermeiras que trabalham à noite em comparação com mulheres saudáveis e hábitos normais e avaliou-se a expressão do receptor MT1 e GLUT1 em tumores de mama e correlacionou com os subtipos moleculares, características patológicas e prognóstico. Foi coletado sangue de 53 mulheres com câncer de mama sendo 47 sem tratamento e 6 em quimioterapia adjuvante, 19 mulheres saudáveis sendo 1 O enfermeiras de turno noturno e 9 mulheres de hábitos normais. Os compostos foram quantificados por espectrometria de massas. Para a expressão de MT1 e GLUT1 foi realizada imunohistoquímica em 42 tumores de mama. Os resultados mostraram que mulheres com câncer de mama tiveram níveis menores de melatonina em comparação com mulheres de hábitos normais (p< 0.01 ), níveis ainda mais baixos em enfermeiras que trabalham no período noturno e em pacientes em quimioterapia adjuvante (p<0.01). Não houve diferença significativa nos níveis de AFMK e AMK entre os grupos (p>0.05). Além disso, pacientes com metástase apresentaram níveis elevados de melatonina e AFMK (p=0.02 e p=0.01, respectivamente) e altos níveis de AFMK estavam presentes quando linfonodos estavam acometidos (p=0.04), pacientes com tumores maiores que 20mm e que dormem com luz à noite (p=0.02 e p=0.007, respectivamente). Na análise imunohistoquímica, alta expressão do MT1 foi associada ao subtipo Luminal A, melhor prognóstico (p<0.05) e em tumores RE+ (p=0.002), enquanto que a expressão elevada de GLUT1 foi associada ao triplo­negativo, pior prognóstico (p<0.05), tumores maiores que 20mm 9p=0.004) e baixa em tumores RE+ (p=0.003). Em conclusão, nossos resultados mostram menores níveis de melatonina em pacientes com câncer de mama e apontam para o benefício da suplementação de melatonina como proteção para mulheres que trabalham à noite o que poderia reduzir o risco de desenvolvimento de câncer de mama. Os resultados da imunohistoquímica indicam que o MT1 e o GLUT1 podem ser utilizados como marcadores prognósticos e são potenciais alvos para o tratamento do câncer de mama. De acordo com os resultados pode­se concluir que a quebra do ciclo circadiano e, portanto, alterações nos níveis de melatonina e a expressão de MT1 e GLUT1 podem estar relacionadas com o risco de desenvolvimento e prognóstico do câncer de mama.
  • ItemTese de doutorado
    Citotaxonomia e evolução cromossômica na subfamília Triatominae
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-10-23) Alevi, Kaio Cesar Chaboli [UNESP]; Oliveira, Maria Tercília Vilela de Azeredo [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A taxonomia e a sistemática dos triatomíneos baseiam-se, principalmente, em caracteres morfológicos. No entanto, existem espécies muito semelhantes ou até mesmo idênticas (espécies crípticas) do ponto de vista morfológico. Dessa forma, novas abordagens são necessárias para caracterizar um táxon e análises citogenéticas têm se mostrado como importantes ferramentas para a caracterização taxonômica e o conhecimento evolução desses vetores. Assim, o presente trabalho teve como objetivos principais: caracterizar os subcomplexos Brasiliensis, Rubrovaria, Matogrossensis, Maculata e Rubrofasciata; auxiliar na revalidação de Triatoma bahiensis; avaliar o status específico de Rhodnius montenegrensis, Rhodnius sp. (afim de R. neglectus), T. pintodiasi, T. lenti e T. sherlocki; analisar a relação evolutiva da tribo Rhodniini; caracterizar o fenômeno de persistência nucleolar na subfamília Triatominae e analisar a variabilidade genética intraespecífica de T. sordida proveniente do Brasil. Os resultados obtidos permitiram caracterizar citogeneticamente as espécies do subcomplexo Brasiliensis; revalidar T. bahiensis e corroborar que essa espécie, bem como T. lenti e T. petrocchiae são membros do subcomplexo Brasiliensis; corroborar o status específico de T. lenti, T. sherlocki e T. bahiensis pela presença de barreira de isolamento reprodutivo pós-zigótica (desmoronamento do híbrido); sugerir que durante a muda imaginal, os triatomíneos cessam a meiose e estimulam a espermiogênese para diminuir os gastos energéticos e garantir a chance de paternidade; caracterizar citogeneticamente os subcomplexos Matogrossensis e Rubrovaria e distingui-los dos outros subcomplexos da América do Sul; reagrupar as espécies dos subcomplexos Matogrossensis, Sordida, Maculata e Rubrovaria, com base na disposição do DNAr 45S; propor a criação de um novo subcomplexo (subcomplexo T. vitticeps), com base em dados fenotípicos e genotípicos; caracterizar citogeneticamente o subcomplexo Maculata e diferenciar T. wygodzinskyi e T. arthurneivai; diferenciar T. rubrofasciata de todas as outras espécies de triatomíneos pela citotaxonomia e cariossistemática; corroborar, por meio da análise cariotípica e das espermátides, que a tribo Rhodniini é um grupo monofilético; caracterizar a evolução cromossômica no grupo pallescens e relacionar a perda de heterocromatina com a ocupação de diferentes ambientes; corroborar o status específico de R. montenegrensis (com base na posição do DNAr 45S) e de T. pintodiasi (com base no comportamento meiótico e na distância genética para o gene mitocondrial 16S); demonstrar que R. neglectus não apresenta variação cromossômica intraespecífica e descrever uma nova espécies do gênero Rhodnius, a saber, R. taquarussuensis sp. n.; discorrer sobre a evolução cariotípica nas tribos Rhodniini, Triatomini e Cavernicolini; confirmar o fenômeno de persistência nucleolar como uma sinapomorfia de Triatominae e, por fim, demonstrar que T. sordida do Brasil não apresenta variação cromossômica intraespecífica e corroborar o status desses vetores como T. sordida sensu strito. Esses resultados mostraram-se de extrema importância para elucidar várias questões sobre a biologia, taxonomia e evolução dos triatomíneos.
  • ItemTese de doutorado
    Análise da proteína Anexina A1 na diferenciação morfofenotípica e funcional dos mastócitos no câncer colorretal
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-06-30) Azevedo, Lucas Ribeiro de [UNESP]; Oliani, Sonia Maria [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer colorretal (CCR) é o terceiro mais comum no mundo e a quarta causa de morte por câncer no ocidente. A origem e desenvolvimento dessa patologia têm sido amplamente associados com alterações no estado inflamatório do intestino. A Anexina A1 (AnxA1) é uma proteína anti-inflamatória envolvida na manutenção da homeostase intestinal e na regulação do desenvolvimento tumoral. Os mastócitos (MCs), que também expressam AnxA1, são amplamente envolvidos nos danos associados no trato gastrointestinal promovido por agentes carcinógenos. No presente estudo foi avaliado o papel da AnxA1 na resposta funcional de MCs na carcinogênese colorretal induzida por N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG). Para esse objetivo, animais deficientes de AnxA1 (AnxA1-/-) receberam instilações de MNNG e o efeito agudo do composto foi avaliado após 8, 24 e 48h. Nossos resultados mostram que o MNNG induz, no epitélio do cólon, aumento da expressão da AnxA1, que limita a lesão tecidual e inflamação local, regulando a produção exacerbada de IL-1, IL-6, IL-12, TNF- α, INF- γ na condição controle e, principalmente, após 24h da exposição. A AnxA1 também reduz a migração e desgranulação de MCs, polarizando a diferenciação dessas células para maior expressão de quimase após o dano carcinogênico. Em seguida, a contribuição dos MCs à tumorigênese induzida pelo MNNG foi avaliada 24 semanas após a exposição crônica dos camundongos deficientes de mastócitos (Kit-/-) ao composto. Nessas condições foi observado aumento do número de MCs totais, desgranulados, triptase e quimase positivos e o desenvolvimento de lesões tumorais nos animais selvagens (Kit+/+) e reconstituídos de mastócitos (Kit-/-+MC). Diferentemente, foi verificada menor susceptibilidade aos tumores induzidos por MNNG nos Kit-/-. Na condição crônica, o MNNG promoveu a formação de um microambiente imunorregulado rico em AnxA1, com baixa expressão das citocinas estudadas e aumento de IL-4. Esse cenário imunossupressor sugere dependência dos MCs, células que também foram associadas com a maior proliferação de células epiteliais colônicas. Em conjunto, os resultados obtidos indicam a AnxA1 como um possível alvo terapêutico no CCR, pois regula os danos iniciais induzidos pelo MNNG e a atividade e diferenciação dos MCs que, cronicamente, contribuem para o desenvolvimento dos tumores.
  • ItemTese de doutorado
    Associação de polimorfismos do receptor TCR e dos genes da IL1 e IL2 com a infecção por Plasmodium vivax no município de Goianésia do Pará, Estado do Pará
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-04-11) Capobianco, Marcela Petrolini [UNESP]; Machado, Ricardo Luiz Dantas [UNESP]; Domingos, Claudia Regina Bonini [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    No Brasil o Plasmodium vivax é a espécie mais prevalente, responsável por aproximadamente 85% dos casos de malária. Ademais as variantes da proteína circumesporozoíta (CSP - VK210, VK247 e P. vivax-like) já foram identificadas em várias áreas endêmicas no país. Diversos estudos analisando a influência da variabilidade genética de receptores celulares e moléculas envolvidas na resposta imune, com diferentes peptídeos do Plasmodium, têm obtido resultados variáveis de acordo com o antígeno utilizado e a população analisada. Este trabalho apresenta resultados sobre o estudo de polimorfismos genéticos no TCR (T cell Receptor) e nas Interleucinas 1 e 2 em pacientes infectados por P. vivax provenientes do município de Goianésia do Pará, no Estado do Pará. Avaliou-se estes polimorfismos com a parasitemia do indivíduo, com os genótipos da CSP e com a resposta sorológica contra os peptídeos da CSP. Foram relacionados também estes polimorfismos com os níveis de citocinas. Os polimorfismos foram analisados por técnicas de PCR-RFLP e PCR alelo específico. As análises sorológicas da CSP foram realizadas por ELISA. Foram comparadas as frequências genotípicas observadas segundo o teorema de Hardy-Weinberg (HW). Os níveis de IL1 e IL2 foram avaliados por citometria de fluxo, seguindo protocolo descrito pelo fabricante. Associação dos polimorfismos com os níveis de interleucinas foi avaliada por Análise de variância. As frequências genotípicas e alélicas foram obtidas no programa R v 2.11.1. A parasitemia variou de 15 a 70.000, com mediana de 1.500 parasitos/mm3. Os SNPS investigados mostraram frequências variadas na amostra estudada. Todo o polimorfismo avaliado encontra-se em Equilíbrio de Hard Wenberg. Não houve diferença significativa da parasitemia em relação aos SNPs investigados. Infecções contendo apenas a variante VK247 foram as mais comuns e também não foi observado diferença significativa na resposta de anticorpos de acordo com a variante da CSP presente no momento da infecção. Correlações significativas entre os níveis destas interleucinas com a parasitemia e os níveis de anticorpos contra as variantes da CSP não foram observadas. Além disso, as variantes da CSP não influenciaram os níveis plasmáticos das citocinas e não houve associações positivas entre os SNPs das IL1 e IL2 e seus níveis plasmáticos. Os resultados poderão contribuir na identificação e participação efetiva de genes humanos na modulação da resposta imune, essenciais no estabelecimento de estratégias de imunização contra a doença, em área de transmissão ativa no Estado do Pará.
  • ItemTese de doutorado
    Ação do peptídeo ANXA1Ac2-26 in vitro: interação com meio condicionado de células endoteliais em carcinoma de colo de útero
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-03-03) Cardin, Laila Toniol [UNESP]; Rodrigues-Lisoni, Flávia Cristina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    O câncer cervical é uma das principais neoplasias ginecológicas em todo o mundo. O microambiente tumoral influencia no processo tumorigênico. Nas diferentes fases da tumorigênese as inflamações crônicas estão envolvidas. Assim, a proteína anti-inflamatória anexina A1 (ANXA1), que é expressa pelas células tumorais, tem sido relacionada ao processo tumorigênico. Diante dessas considerações, o objetivo do presente trabalho foi investigar a ação do peptídeo mimético da proteína ANXA1 em células de carcinoma de colo de útero. As metodologias utilizadas foram Análise de proliferação, migração, viabilidade e apoptose celular, além da modulação da expressão de genes relacionados à inflamação por PCR quantitativa. No primeiro modelo, foi utilizado o Meio Condicionado da linhagem HUVEC (endotélio) (HMC) para realizar o cultivo celular junto as linhagens HaCat (normal) e HeLa (câncer). Nossos resultados mostram que as células de câncer cervical apresentam diminuição da proliferação, enquanto na morfologia, migração, viabilidade e apoptose celular não foram observadas mudanças. A análise dos genes, MMP2 e MMP9 mostrou aumento de expressão, enquanto os genes COX2, EP3 e EP4 diminuição, após estímulo com HMC. No segundo modelo, foi realizada comparação de duas linhagens tumorigênicas (HeLa e SiHa) com a linhagem HaCaT. A ANXA1 aumentou a expressão de EP4 e MMP9 e diminuiu a proliferação celular e a apoptose. Nesse contexto sugerimos que o peptídeo pode modular mecanismos celulares e moleculares na carcinogênese cervical, porém seu uso como possível alternativa terapêutica deve ser melhor estudado.
  • ItemTese de doutorado
    Avaliação da influência de Fusobacterium nucleatum na modulação de citocinas e microRNAs em adenoma e câncer colorretal
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-03-03) Proença, Marcela Alcântara [UNESP]; Silva, Ana Elizabete [UNESP]; Hughes, David J.; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Colorectal cancer (CRC) is associated with pathogens such as Fusobacterium nucleatum (Fn), which can provide a favorable microenvironment for tumorigenesis due to inflammatory changes. In order to understand the effect of Fn on the microenvironment of intestinal lesions, the relative quantification (RQ) of this bacterium was evaluated in samples of colorectal adenoma tissue (CRA) and CCR, as well as its correlation with the mRNA expression of inflammatory mediators (TLR2, TLR4, NFKB1, TNF, IL1B, IL6 e IL8), and microRNAs (miR-21-3p, miR-22-3p, miR-28-5p, miR-34a-5p e miR-135b-5p) involved in the inflammatory response and carcinogenesis. A miRNA: mRNA interaction network was also delineated to aid in the understanding of miRNA participation in the carcinogenic process. DNA and RNA were extracted from 27 fresh tissue samples of CRA and 43 of CRC and their respective adjacent normal ones. Fn and mRNA levels of the inflammatory mediators and miRNAs were quantified by quantitative real-time PCR (qPCR). Elevated levels of Fn were detected in CRA (RQ=5.64 and more markedly in CRC (RQ=8.67). High mRNA expression of TLR4, IL1B, IL8 and miR-135b in CRA, and of TLR2, IL1B, IL6, IL8, miR-34a and miR-135b in CRC were observed in comparison with their respective normal tissues. In addition, miR-22 and miR-28 were found downregulated in CRC. The mRNA expression of IL1B, IL6, IL8 and miR-22 was positively correlated with the quantification of Fn in CRC. The mRNA expression of miR-135b and TNF was inversely correlated in tumor tissue, suggesting TNF as a possible target of this miRNA in CRC. The interaction miRNA:mRNA network suggest that the increased expression of miR-34a in CRC can regulates TLR4 favoring the recognition of Fn by TLR2, which is upregulated in tumor tissue, whereas in CRA this recognition must be mainly via TLR4. These results suggest an increase in Fn colonization during the progression of the adenoma-adenocarcinoma pathway, indicating it as a risk factor for colorectal carcinogenesis. The abundance of this bacterium in the gut promotes increased expression of inflammatory mediators such as IL1B, IL6 and IL8 through their recognition by TLR2 or TLR4, depending on the interaction with differentially expressed miRNAs.
  • ItemTese de doutorado
    Perfil fenotípico de gravidade na doença falciforme: interação gênica e/ou características intrínsecas da manifestação clínica?
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-02-23) Okumura, Jéssika Viviani [UNESP]; Bonini-Domingos, Claudia Regina [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    Os indivíduos com Doença Falciforme (DF) apresentam manifestações clínicas variáveis que podem ser decorrentes de fatores genéticos e ambientais. O presente trabalho teve como objetivo investigar se os marcadores genéticos relacionados à vasoatividade e coagulação modulam a gravidade clínica em pessoas com DF em quatro faixas etárias. Para isso, dois grupos longitudinais foram formados, o prospectivo, que avaliou 59 crianças com DF nascidas no período de maio de 2012 a dezembro de 2013, e o retrospectivo, que avaliou 392 pessoas com DF no ano de 2011. Estes dois grupos foram divididos em quatro subgrupos de estudo, de acordo com a faixa etária, em: Crianças I (de 0 a 4 anos de idade, N=59), Crianças II (de 5 a 10 anos, N=53), Adolescentes (11 a 19 anos, N=127) e Adultos (acima de 20 anos de idade, N=212). Todos os indivíduos foram genotipados para a DF, para os haplótipos da globina beta-S, e para os polimorfismos genéticos nos genes da cistationina beta-sintase (CBS, 844ins68), enzima conversora de angiotensina I (ECA1, I/D 287 pb), enzima conversora de angiotensina II (ECA2, A1075G), inibidor do ativador do plasminogênio tipo I (PAI1, -675pb 4G/5G) e adenosina deaminase (ADA, G22A). A classificação do perfil fenotípico de gravidade do subgrupo Crianças I foi realizado pelo hematologista do HEMORIO (RJ), e dos subgrupos Crianças II, Adolescentes e Adultos pela calculadora online “Sickle Cell Disease Severity Calculator”. Com excessão do genótipo SC que foi mais frequente no subgrupo Crianças I, as frequências genotípicas e alélicas para os marcadores genéticos avaliados não diferiram entre os quatro subgrupos amostrais, porém foi verificada elevada frequência de: genótipo SS (anemia falciforme - AF), haplótipo Bantu, alelo Ins- para a CBS, alelo 5G para o PAI1, alelo D para ECA1, alelo G para ECA2 e o alelo G para ADA. Quanto aos perfis fenotípicos de gravidade clínica, no subgrupo Crianças I, Crianças II e Adolescentes, as formas leve e moderado se destacaram. No subgrupo Adultos, perfís moderado e grave estiveram presentes em aproximadamente 90% dos indivíduos. Na avaliação dos marcadores genéticos como interferentes na gravidade clínica dos indivíduos, foi verificado para o grupo prospectivo que o genótipo SS contribui com aproximadamente 22 vezes mais risco de ocorrência de clínica moderada e grave. Quando avaliados somente os indivíduos com AF do grupo prospectivo, o genótipo GG para o polimorfismo A1075G da ECA2 apresentou efeito protetor, por diminuir a ocorrência das manifestações moderadas e graves. Para o grupo retrospectivo, a presença do genótipo SS aumentou a chance de ocorrência de clínica moderada e grave em aproximadamente oito vezes e só grave um aumento de quatro vezes. Com esses resultados foi possível concluir que o genótipo SS interfere diretamente na gravidade clínica dos indivíduos com DF, e o genótipo GG do gene ECA2, apresentou efeito protetor contra perfis moderado e grave nas crianças com AF.
  • ItemTese de doutorado
    Análise dos aspectos ultraestruturais da espermatogênese de Heteroptera
    (Universidade Estadual Paulista (Unesp), 2017-02-17) Pereira, Luis Lenin Vicente [UNESP]; Itoyama, Mary Massumi [UNESP]; Universidade Estadual Paulista (Unesp)
    A subordem Heteroptera possui sete infraordens com aproximadamente 80 famílias. A maioria ocorre em todos os continentes (exceto Antártica) e algumas ilhas. Além dos Heteroptera terrestres, há os aquáticos e semi-aquáticos que são amplamente distribuídos, e surpreendem por sua capacidade de habitar uma extraordinária variedade de ecossistemas, sendo encontrados em habitats de água doce e marinho, e variada faixa de altitude entre 0 e 4.700 m. Estudos sobre aspectos ultraestruturais da espermatogênese e, especificamente, a estrutura do espermatozoide em Heteroptera ainda são escassos, por este motivo o objetivo do presente estudo foi o de analisá-los, por meio de cortes semifinos corados com azul de toluidina ou impregnados por íons prata, e cortes ultra-finos analisados em microscopia eletrônica de transmissão, utilizando testículos de machos adultos das famílias Belostomatidae, Gelastocoridae, Gerridae, Mesoveliidae, Notonectidae e Veliidae. Após a análise ultraestrutural da espermatogênese foi possível determinar que o padrão flagelar do axonema é de 9+9+2 para todas as espécies analisadas sendo, portanto, o padrão para essa subordem, as mitocôndrias durante a espermatogênese assumem diferentes morfologias, sendo que inicialmente as mitocôndrias se unem formando o complexo mitocondrial e, posteriormente, se divide em dois derivados mitocondriais que estão posicionados bilateralmente em relação ao axonema. Os derivados mitocondriais apresentaram tamanhos diferentes para as espécies B. amnigenus (Notonectidae) e R. c. crassifemur (Gerridae) e para as demais espécies o tamanho foi semelhante. As células germinativas possuem em seu citoplasma o acúmulo de um material denominado corpo cromatóide estando localizado próximo ao núcleo. Com relação ao comportamento nucleolar da espécie Martarega brasiliensis foi observado de um a quatro corpúsculos nucleolares em células de Prófase I comprovando uma grande atividade sintética das células nessa fase da divisão celular. Células em Metáfase I apresentaram regiões organizadoras nucleolares na região telomérica de um dos autossomos. Ainda, nessa espécie, foi possível observar, em Anáfase I, vários corpúsculos nucleolares persistindo até a fase de Telófase I. Todas as ultraestruturas descritas nas espécies analisadas foram semelhantes às descritas na literatura para Heteroptera, corroborando as características sinapomórficas dessa subordem sendo elas: a) a presença de duas pontes que ligam o material intertubular do axonema flagelar às cisternas achatadas que aderem aos lados internos dos derivados mitocondriais; b) padrão flagelar do axonema de 9+9+2 e c) ausência de corpos acessórios.