Estudo da proteína espermática EPPIN como alvo para contracepção masculina: caracterização estrutural, interação proteína-proteína e potenciais mecanismos de ação.

Abstract

A EPPIN (Epididymal protease inhibitor) é um alvo farmacológico para contracepção masculina, devido ao seu papel crítico na função do espermatozoide. A EPPIN é expressa pelas células testiculares e epididimárias, e está presente na superfície dos espermatozoides humanos, onde atua inibindo a motilidade espermática após a ejaculação via interação com a proteína seminal semenogelina-1 (SEMG1). Pouco se conhece, no entanto, sobre os mecanismos pelos quais a EPPIN modula a motilidade espermática, bem como seus papeis adicionais na reprodução. Recentemente, demonstramos um sistema equivalente de interação EPPIN/SEMG1 no espermatozoide murino, o que indica que a EPPIN também tem papel no controle da motilidade espermática nessa espécie. Neste projeto, nosso objetivo foi investigar o papel da EPPIN na função do espermatozoide murino, com ênfase no seu perfil de interação com a SEMG1 e potenciais mecanismos de ação no controle da motilidade espermática. Ensaios de interação proteína-proteína confirmaram a interação entre a EPPIN e SEMG1 murina recombinantes (EPPINm e SEMG1m, sequências inteiras sem o peptídeo sinal), sendo que o fragmento recombinante R98-G375 da SEMG1 (SEMG1mR98-G375) interagiu com a EPPIN de maneira similar à SEMG1m inteira, enquanto os fragmentos Q32-V118 (SEMG1mQ32-V118) e Y221-G375 (SEMG1mY221-G375) tiveram porcentagem de ligação à EPPINm de somente 20% e 30%, respectivamente. Ensaios de CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) revelaram que a SEMG1m inibiu a motilidade progressiva [IC50 = 13,5 µM (0,9-194,2); média (95% de intervalo de confiança)], e hiperativada [IC50 = 6,8 µM (1,4-32,9)] de forma dependente da concentração. Interessantemente, tanto o fragmento SEMG1mR98-G375, que contém o principal domínio de interação com a EPPIN, quanto o SEMG1mQ32-V118 inibiram a hiperativação. O efeito inibitório da SEMG1m sobre a hiperativação espermática foi associado à inibição do canal de Ca2+ específico do espermatozoide CatSper, conforme demonstrado por ensaios de eletrofisiologia para avaliar a corrente deste canal no espermatozoide murino. Consistentemente com esses achados, ensaios de Western blot e imunofluorescência revelaram a presença da EPPIN e SEMG1 nos espermatozoides isolados de diferentes regiões do trato reprodutor feminino após a ejaculação. Observamos colocalização da EPPIN com a SEMG1 na cabeça e flagelo de espermatozoides isolados da vagina e útero, porém em menor grau para os espermatozoides isolados de regiões próximas ao oviduto. Nossos resultados demonstram que a inibição da hiperativação espermática induzida pela SEMG1 está relacionada à inibição do CatSper, um efeito que, embora associado, não depende apenas da sua ligação à EPPIN. A identificação das sequências-chave da SEMG1 necessárias para a sua ligação à EPPIN (R98-S220), e inibição da hiperativação (Q32-S220) via inibição do canal CatSper, pode facilitar o desenvolvimento de novas moléculas capazes de mimetizar os efeitos dessa proteína sobre a função espermática, promovendo inovações significativas na descoberta e desenho de novos fármacos com potencial contraceptivo masculino não-hormonal.

EPPIN (Epididymal Protease Inhibitor) is a pharmacological target for male contraception due to its critical role in sperm function. EPPIN is expressed by testicular and epididymal cells and is present on the surface of human sperm, where it inhibits sperm motility after ejaculation through interaction with the seminal protein semenogelina-1 (SEMG1). However, little is known about the mechanisms by which EPPIN modulates sperm motility and its additional roles in reproduction. Recently, we demonstrated an equivalent EPPIN/SEMG1 interaction system in mouse sperm, indicating that EPPIN also controls sperm motility in this species. In this project, our objective was to investigate the role of EPPIN in mouse sperm function, focusing on its interaction profile with SEMG1 and potential mechanisms of action in controlling sperm motility. Protein-protein interaction assays confirmed the interaction between recombinant mouse EPPIN and SEMG1 (mEPPIN and mSEMG1; full-length sequences lacking the signal peptide), with the recombinant fragment R98-G375 of SEMG1 (mSEMG1R98-G375) interacting with mEPPIN similarly to the full-length mSEMG1. Conversely, the fragments Q32-V118 (mSEMG1Q32-V118) and Y221-G375 (mSEMG1Y221-G375) showed only 20% and 30% binding to EPPIN, respectively. CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis) assays revealed that SEMG1m inhibited progressive motility [IC50 = 13.5 µM (0.9-194.2); mean (95% confidence interval)], and hyperactivation [IC50 = 6.8 µM (1.4-32.9)] in a concentration-dependent manner. Interestingly, the mSEMG1R98-G375 fragment, which contains the main EPPIN-binding domain, and mSEMG1Q32-V118 inhibited hyperactivated motility but did not affect progressive motility. Their inhibitory effect on sperm hyperactivation was associated with inhibiting the sperm-specific Ca2+ channel CatSper, as demonstrated by electrophysiology assays evaluating this channel's current in mouse sperm. Consistent with these findings, Western blot assays revealed the presence of EPPIN and SEMG1 in sperm isolated from different regions of the female reproductive tract after ejaculation, but with a lower abundance in sperm isolated from regions near the oviduct. Our results demonstrate that the inhibition of SEMG1-induced sperm hyperactivation relies on CatSper channel inhibition, an effect that depends, albeit not exclusively, on EPPIN binding. The identification of key SEMG1 sequences necessary for EPPIN binding (R98-S220) and hyperactivation inhibition (Q32S220), via CatSper channel blockade, may facilitate the development of new molecules capable of mimicking the effects of this protein on sperm function, promoting significant innovations in the discovery and design of new drugs with potential non-hormonal male contraceptive properties.