Hidrogéis de quitosana livre de células e reforçados por nanotubos de carbono e nanopartículas de hidroxiapatita para aplicação em tecido ósseo

Abstract

Este estudo apresenta o desenvolvimento e caracterização de um hidrogel de quitosana injetável, livre de células, reforçado com nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) e nanopartículas de hidroxiapatita (nHA) para aplicação em engenharia de tecido ósseo. O hidrogel visa melhorar as propriedades mecânicas, biocompatibilidade e osteocondutividade, oferecendo uma solução potencial para a regeneração óssea. A funcionalização dos MWCNTs foi realizada por meio de um ataque ácido assistido por banho ultrassônico, aumentando significativamente a carga de superfície e reduzindo o tamanho das partículas. Este processo garantiu melhor interação com a matriz de quitosana, prevenindo a floculação e promovendo a formação uniforme do hidrogel. A Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) confirmou a incorporação bem-sucedida de grupos funcionais da quitosana, MWCNT e nHA, indicando a integração eficaz dos materiais. A estabilidade física e química dos hidrogéis foi avaliada por meio de testes de intumescimento e degradação. Os hidrogéis exibiram propriedades de intumescimento significativas e taxas de degradação controladas em água deionizada e solução salina tamponada com fosfato (PBS), essenciais para manter a integridade estrutural enquanto suportam o crescimento celular. A análise termogravimétrica (TGA/DTA) demonstrou ainda a estabilidade térmica do hidrogel, confirmando sua adequação para aplicações biomédicas. As análises morfológicas e elementares, utilizando Microscopia Eletrônica de Varredura (SEM) e Espectroscopia de Dispersão de Energia (EDS), revelaram uma estrutura porosa bem definida e a presença de cálcio e fósforo, indicando a integração bem-sucedida da nHA na matriz do hidrogel. Essas características são cruciais para mimetizar o ambiente ósseo natural e promover a adesão e proliferação celular. A biocompatibilidade foi avaliada por meio de testes de citotoxicidade e adesão celular utilizando pré-osteoblastos MC3T3-E1. Os resultados mostraram alta viabilidade celular e forte adesão, destacando o potencial do hidrogel para suportar a atividade dos osteoblastos e a regeneração do tecido ósseo. A viabilidade celular foi mantida acima do limiar definido pelas diretrizes ISO 10993-5, confirmando a segurança do material para uso biomédico. A análise da expressão gênica, utilizando a Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa por Transcrição Reversa (RT-qPCR), monitorou a expressão de marcadores osteogênicos chave, incluindo Alp, Tgf-β2, Runx2, Opn, Bglap e Col1a1. A análise demonstrou a regulação positiva desses marcadores, indicando que o hidrogel promove a diferenciação dos osteoblastos e a remodelação da matriz extracelular, processos essenciais para a regeneração óssea eficaz. A atividade das metaloproteinases de matriz (MMP), crucial para a remodelação da matriz extracelular, foi avaliada por ensaios de zimografia. Os resultados mostraram MMPs ativas, particularmente MMP-2 e MMP-9, no ambiente do hidrogel, apoiando a remodelação dinâmica necessária para a regeneração do tecido ósseo. Em conclusão, o hidrogel de quitosana desenvolvido, reforçado com MWCNT e nHA, apresenta propriedades promissoras para aplicações em engenharia de tecido ósseo. Sua robustez mecânica, biocompatibilidade e osteocondutividade fazem dele um candidato viável para uso clínico na regeneração óssea. Este hidrogel oferece uma nova abordagem para o tratamento de lesões e condições relacionadas ao osso, potencialmente melhorando os resultados dos pacientes por meio da reparação e regeneração óssea aprimoradas. A avaliação abrangente de suas propriedades sugere que este hidrogel pode efetivamente suportar a atividade dos osteoblastos e facilitar o complexo processo de remodelação do tecido ósseo, marcando um avanço significativo no campo da medicina regenerativa e engenharia de tecidos.

This study presents the development and characterization of a cell-free chitosan hydrogel reinforced with multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) and hydroxyapatite nanoparticles (nHA) for application in bone tissue engineering. The hydrogel aims to enhance mechanical properties, biocompatibility, and osteoconductivity, providing a potential solution for bone regeneration. The functionalization of MWCNT was achieved through an acid attack assisted by an ultrasonic bath, significantly increasing the surface charge and reducing particle size. This process ensured better interaction with the chitosan matrix, preventing flocculation and promoting uniform hydrogel formation. Fourier Transformed Infrared Spectroscopy (FTIR) confirmed the successful incorporation of functional groups from chitosan, MWCNT, and nHA, indicating effective material integration. Physical and chemical stability of the hydrogels was assessed through swelling and degradation tests. The hydrogels exhibited significant swelling properties and controlled degradation rates in both deionized water and phosphate-buffered saline (PBS), essential for maintaining structural integrity while supporting cell growth. Thermogravimetric analysis (TGA/DTA) further demonstrated the hydrogel's thermal stability, confirming its suitability for biomedical applications. Morphological and elemental analyses using Scanning Electron Microscopy (SEM) and Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) revealed a well-defined porous structure and the presence of calcium and phosphorus, indicative of successful nHA integration into the hydrogel matrix. These characteristics are crucial for mimicking the natural bone environment and promoting cell attachment and proliferation. Biocompatibility was evaluated through cytotoxicity and cell adhesion tests using MC3T3-E1 pre-osteoblasts. The results showed high cell viability and strong adhesion, highlighting the hydrogel's potential to support osteoblast activity and bone tissue regeneration. The cell viability was maintained above the threshold defined by ISO 10993-5 guidelines, confirming the material's safety for biomedical use. Gene expression analysis using Reverse Transcription-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) monitored the expression of key osteogenic markers, including Alp, Tgf-β2, Runx2, Opn, Bglap, and Col1a1. The analysis demonstrated the upregulation of these markers, indicating that the hydrogel promotes osteoblast differentiation and extracellular matrix (ECM) remodeling, essential processes for effective bone regeneration. Matrix metalloproteinase (MMP) activity, crucial for extracellular matrix remodeling, was assessed using zymography assays. The results showed active MMPs within the hydrogel environment, particularly MMP-2 and MMP9, supporting the dynamic remodeling required for bone tissue regeneration. In conclusion, the developed chitosan hydrogel reinforced with MWCNT and nHA exhibits promising properties for bone tissue engineering applications. Its mechanical robustness, biocompatibility, and osteoconductivity make it a viable candidate for clinical use in bone regeneration. This hydrogel provides a new avenue for treating bone-related injuries and conditions, potentially improving patient outcomes through enhanced bone repair and regeneration. The comprehensive evaluation of its properties suggests that this hydrogel can effectively support osteoblast activity and facilitate the complex process of bone tissue remodeling, marking a significant advancement in the field of regenerative medicine and tissue engineering.