Investigação de substratos biológicos oxidantes de AhpC: aspectos fundamentais e aplicações no combate a bactérias patogênicas

Abstract

Anualmente cerca de 1,3 milhões de mortes são causadas diretamente por linhagens bacterianas resistentes a múltiplos fármacos (MDR) em todo o mundo. Dentre elas, linhagens MDR de Escherichia coli respondem por quase um terço dos óbitos. Para combater os patógenos bacterianos, as células do sistema imune, como macrófagos e neutrófilos, produzem espécies reativas de oxigênio (EROS) as quais são capazes de danificar biomoléculas do patógeno levando a sua morte. Curiosamente a ação de alguns antibióticos também é baseada na produção de EROS. Por outro lado, os patógenos possuem enzimas antioxidantes eficientes que são capazes de mitigar a toxicidade destes compostos. Dentre elas, a peroxirredoxina (Prx) AhpC (Alquil hidroperóxido redutase C), uma peroxidase abundante em bactérias que catalisa a decomposição de hidroperóxidos através de uma cisteína reativa (CP), a qual juntamente com os resíduos Thr/Ser e Arg compõem a tríade catalítica. AhpC pode decompor eficientemente vários tipos de hidroperóxidos como H2O2, NOO- e peróxidos orgânicos sintéticos (k = 10^4-7 M^-1s^-1). Curiosamente, essas enzimas são suscetíveis à inativação irreversível por substratos devido à hiperoxidação de CP. Em bactérias não existe sistema capaz de reduzir este intermediário e a enzima inativa é degradada. Porém, apesar da importância de compreender os substratos naturais da AhpC, nenhum trabalho tentou investigar sistematicamente sua atividade sobre peróxidos orgânicos incluindo os derivados de ácidos graxos de cadeia longa (LCFA-Hpx). No início do desenvolvimento deste trabalho fizemos levantamentos sobre quais LCFA-Hpx são mais abundantes em sistemas biológicos. Foram selecionados os mais frequentemente encontrados em E. coli e/ou bactérias filogeneticamente próximas, e nos concentramos em simulações computacionais, como a construção de modelos teóricos de EcAhpC e dockings dos hidroperóxidos selecionados. O modelo teórico final de EcAhpC apresentou diagrama de Ramachandran com todos os resíduos em regiões permitidas e pontuação de confiança por resíduo (pLDDT) produzida pelo AlphaFold de até 99%. Os LCFA-Hpx que apresentaram os melhores fittings para EcAhpC, foram os hidroperóxidos de ácido oleico (Ol-OOH), linolênico (Ln-OOH) e linoleico com uma ou duas funções peróxido (1-Li-OOH e 2-Li-OOH, respectivamente), aqueles que apresentaram a função peróxido em grande proximidade ao Sγ reativo da CP (DSγ = 3,44 a 3,86Å), energia livre de Gibbs (ΔG) de -5,8 a -5,2 kcal/mol sendo estabilizados por um elevado número de interações hidrofóbicas e polares. Os resultados bioquímicos revelaram que EcAhpC possui maior afinidade por Li-OOH (Km = 4.16 μM) que por H2O2 ou CHP (Km = 56.59 μM e 31.62 μM, respectivamente) o que, a princípio, poderia favorecer a inativação por hiperoxidação. Os resultados com o Ol-OOH através dos resultados do ensaio acoplado de NADPH, revelaram um Km = 10.91 μM e uma queda da atividade enzimática a 75 μM para esse peróxido, apontando para uma preferência da enzima por LCFA-Hpx. A partir disso, iniciamos as análises comparativas de hiperoxidação por immunoblotting com anti-Prx-SO2/3, sendo possível observar um maior perfil de hiperoxidação para Li-OOH quando comparado ao H2O2. Durante as análises das constantes de segunda ordem de EcAhpC por meio de cinética rápida utilizando stopped flow para detectar alterações da fluorescência intrínseca do triptofano entre espécies reduzidas, oxidadas ou hiperoxidadas de AhpC, não foi possível determinar as constantes confiáveis uma vez que alteração de fluorescência entre os diferentes estados de oxidação é insignificante e as constantes determinadas foram muito baixas tanto para o H2O2 quanto para peróxidos de lipídeos (~ 10^3 M^-1s^-1), mesmo com as diversas abordagens alterando as concentrações de enzimas, substratos oxidantes e/ou temperatura. Tais resultados nos levaram a investigar mais sobre as razões deste fenômeno, uma vez que EcAhpC possui estrutura altamente similar à de outras bactérias com constantes com peróxidos (H2O2 e ONOOH) já determinadas (~ 10^7-8 M^-1s^-1). As investigações estruturais indicaram que, substituições de aminoácidos próximo aos resíduos de Trp podem estar envolvidos neste fenômeno e foram desenhados e adquiridos oligonucleotídeos mutagênicos para substituições dos aminoácidos. Adicionalmente como as razões que impossibilitam a determinação das constantes por cinética rápida são estruturais, também iniciamos procedimentos para determinar a estrutura de EcAhpC em diferentes estados oligoméricos oxidativos.

An annual total of approximately 1.3 million deaths are directly caused by bacterial strains resistant to multiple drugs (MDR) worldwide. Among them, MDR strains of Escherichia coli account for almost one-third of the fatalities. In the fight against bacterial pathogens, immune system cells such as macrophages and neutrophils produce reactive oxygen species (ROS) capable of damaging pathogen biomolecules, leading to their demise. Interestingly, the action of some antibiotics is also based on the production of ROS. On the other hand, pathogens possess efficient antioxidant enzymes that can mitigate the toxicity of these compounds. Among them, alkyl hydroperoxide reductase C (AhpC) peroxiredoxin is abundant in bacteria and catalyzes the decomposition of hydroperoxides through a reactive cysteine (CP), which, along with Thr/Ser and Arg residues, forms the catalytic triad. AhpC can efficiently decompose various types of hydroperoxides such as H2O2, NOO-, and synthetic organic peroxides (k = 10^4-7 M^-1s^-1). Interestingly, these enzymes are susceptible to irreversible inactivation by substrates due to CP hyperoxidation. In bacteria, there is no system capable of reducing this intermediate, and the inactivated enzyme is degraded. Despite the importance of understanding the natural substrates of AhpC, no work has systematically attempted to investigate its activity on organic peroxides, including long-chain fatty acid derivatives (LCFA-Hpx). At the beginning of this study, we surveyed which LCFA-Hpx are most abundant in biological systems. The most frequently found in E. coli and/or phylogenetically related bacteria were selected, and we focused on computational simulations, such as the construction of theoretical models of EcAhpC and dockings of selected hydroperoxides. The final theoretical model of EcAhpC showed a Ramachandran diagram with all residues in allowed regions and a residue confidence score (pLDDT) produced by AlphaFold of up to 99%. LCFA-Hpx that showed the best fittings for EcAhpC were oleic acid hydroperoxides (Ol-OOH), linolenic acid (Ln-OOH), and linoleic acid with one or two peroxide functions (1-Li-OOH and 2-Li-OOH, respectively), those with the peroxide function in close proximity to the reactive CP's Sγ (DSγ = 3.44 to 3.86 Å), Gibbs free energy (ΔG) of -5.8 to -5.2 kcal/mol, stabilized by a high number of hydrophobic and polar interactions. Biochemical results revealed that EcAhpC has a higher affinity for Li-OOH (Km = 4.16 μM) than for H2O2 or CHP (Km = 56.59 μM and 31.62 μM, respectively), which could favor hyperoxidation-induced inactivation. Results with Ol-OOH through the NADPH-coupled assay showed a Km = 10.91 μM and a drop in enzymatic activity at 75 μM for this peroxide, indicating the enzyme's preference for LCFA-Hpx. Subsequent comparative analyses of hyperoxidation by immunoblotting with anti-Prx-SO2/3 revealed a higher hyperoxidation profile for Li-OOH compared to H2O2. During the analysis of EcAhpC second-order constants through fast kinetics using stopped flow to detect changes in the intrinsic tryptophan fluorescence between reduced, oxidized, or hyperoxidized AhpC species, reliable constants could not be determined. Fluorescence changes between different oxidation states were insignificant, and the determined constants were very low for both H2O2 and lipid peroxides (~ 10^3 M^-1s^-1), even with various approaches altering enzyme concentrations, oxidant substrates, and/or temperature. These results prompted further investigation into the reasons for this phenomenon, as EcAhpC has a highly similar structure to other bacteria with peroxide constants (H2O2 and ONOOH) already determined (~ 10^7-8 M^-1s^-1). Structural investigations indicated that amino acid substitutions near Trp residues might be involved in this phenomenon, and mutagenic oligonucleotides were designed and acquired for amino acid substitutions. Additionally, as the reasons preventing the determination of constants by fast kinetics are structural, we also initiated procedures to determine the structure of EcAhpC in different oxidative oligomeric states.