Análise Estrutural do Componente Telomerase Transcriptase Reversa de Leihmania major
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Data
2018-07-25
Orientador
Nogueira Cano, Maria Isabel ![](assets/repositorio/images/logo-unesp.png)
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Henrique Fernandes, Carlos Alexandre ![](assets/repositorio/images/logo-unesp.png)
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Coorientador
Pós-graduação
Ciências Biológicas (Genética) - IBB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
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Resumo
Resumo (português)
Os parasitos do gênero Leishmania são protozoários primitivos entre os quais estão os causadores de um espectro de doenças conhecidas como leishmaniose, as quais afetam milhões de pessoas no mundo inteiro, sendo o Brasil um dos países que apresenta maior número de casos por ano. Os tratamentos e vacinas disponíveis para a leishmaniose apresentam problemas como toxicidade, alto custo e baixa eficiência, tornando importante a busca por novos alvos terapêuticos. Dada sua importância para a estabilidade genômica e proliferação celular, os telômeros têm sido considerados como alvos terapêuticos potenciais no tratamento da leishmaniose. Os telômeros são as extremidades físicas dos cromossomos lineares compostos por complexos ribonucleoproteicos que envolvem a interação entre proteínas, DNA e RNA. A maioria dos eucariotos mantêm o tamanho dos telômeros pela ação do complexo telomerase, que é minimamente composto por uma proteína (TERT, Telomerase Reverse Transcriptase) e um RNA longo não codificador (TER, Telomerase RNA). Os dois componentes do complexo telomerase em Leishmania sp. foram identificados, porém não há informação disponível sobre suas estruturas. O objetivo principal deste estudo foi a caracterização estrutural do componente TERT de Leishmania major. Utilizando alinhamentos múltiplos de sequências, foi possível verificar que os quatro domínios estruturais das telomerases canônicas estão presentes no componente TERT em Leishmania sp. Três destes domínios foram estudados independentemente utilizando várias ferramentas de bioinformática. O domínio TEN (Telomerase essential N-terminal) é o mais amino-terminal e é importante na interação com o DNA telomérico e proteínas teloméricas. Em L. major, este domínio mostra uma baixa conservação de estrutura primária quando comparado com outros eucariotos, mas preserva o único motivo estrutural. Este domínio está composto principalmente por elementos desordenados e hélices-α e mostra uma baixa conservação de estrutura primária quando comparado com outros eucariotos, mas preserva seu motivo funcional característico. O domínio TRB (Telomerase RNA Binding) é importante na interação entre o componente TERT e o componente TER. Em L. major, o domínio TRB apresenta uma conservação estrutural parcial, mas possui substituições em resíduos de aminoácidos próprias do gênero Leishmania que poderiam alterar o mecanismo de interação TERT/TER. O domínio RT é o centro catalítico do TERT. Este domínio é altamente conservado em L. major e apresenta conservação de todos os motivos funcionais, assim como do centro catalítico. Para corroborar os resultados in silico com dados experimentais, os três domínios foram individualmente expressos em sistema heterólogo e protocolos de purificação das proteínas recombinantes são apresentados. O objetivo é utilizar estas proteínas em estudos de interação proteínas-ácidos nucleicos e proteína-proteína para verificar o grau de conservação destas interações, uma vez que nesses parasitos o TERT compartilha características estruturais com outros TERT, embora também apresente peculiaridades do gênero. Os resultados gerados neste trabalho podem fornecer conhecimento sobre a evolução da enzima telomerase e indicar se a telomerase de L. major poderá ser considerada um alvo terapêutico parasita-específico.
Resumo (inglês)
Parasites of the Leishmania genus are primitive protozoa and among them are the causative agents of a spectrum of diseases called leishmaniasis, which affect millions of people in tropical countries worldwide, being Brazil one of the countries with higher number of cases each year. The drugs or vaccines available to treat leishmaniasis present problems such as toxicity, excessive cost a low efficiency, so it is important to search for new potential therapeutic targets. Due to their importance in genome stability and cell proliferation, telomeres have been considered a potential therapeutic target against leishmaniasis. Telomeres are the ends of linear chromosomes composed by ribonucleoproteic complexes that involve the interaction between proteins, DNA and RNA. Most eukaryotes maintain their telomere length by the action of the telomerase complex, minimally composed by a protein (TERT, Telomerase Reverse Transcriptase) and a long non-coding RNA (TER, Telomerase RNA). Both components of the Leishmania sp. telomerase complex have already been identified, however, little is known about their structure. This study had the aim to characterize the structure of the Leishmania major TERT component. Using multiple sequence alignments, we were able to verify that the four structural domains of canonical telomerases are present in Leishmania sp. Using different bioinformatic approaches three of these domains were independently studied. The TEN (Telomerase essential N-terminal) domain is the most amino-terminal and is involved in the interaction between TERT, telomeric DNA and accessory proteins. In L. major this domain is mainly composed by unordered regions and α helixes showing little primary structure conservation when compared to other eukaryotes, although it preserves its unique structural motif. The TRB (Telomerase RNA binding) domain is important for the interaction between TERT and TER. In L. major the TRB domain shows partial structural conservation but presents characteristics that are specific to the genus and that could alter the mechanism of TERT/TER interaction. The RT (Reverse transcriptase) domain is the catalytic center of TERT. It is structurally conserved in L. major, presenting all the functional motifs and conservation of the catalytic core. To corroborate our in-silico results with experimental data, we independently expressed all three domains using heterologous system and purification protocols are presented. Our goal is to perform protein-protein and protein-nucleic acid interaction assays to verify how conserved are these interactions. In these protozoa, TERT shares conserved structural features with other TERT but also present its own peculiarities. The results gathered from these studies will provide insights on the evolution of the telomerase enzyme and will help to determine if L. major telomerase could be considered a parasite-specific therapeutic target.
Descrição
Palavras-chave
Leishmania , telômeros , telomerase , estrutura , bioinformatica , Telomeres , structure , bioinformatic
Idioma
Português