Validação do método REACT- Rapid Emerging Arborvirus Characterization Technology e desenvolvimento de painel de identificação de arbovírus por sequenciamento de nova geração

Abstract

Introdução: Os arbovírus são vírus de RNA relacionados a doenças que podem acometer tanto seres humanos quanto animais, e são transmitidos por artrópodes. Estudos recentes relatam a introdução e emergência (ou reemergência) de arbovírus no Brasil e no mundo que podem afetar a saúde humana e animal, e podem estar associados a fatores ambientais, como umidade, temperatura, os quais favorecem o aumento da população de mosquitos, aumentando o potencial de disseminação dos arbovírus. Assim, o desenvolvimento de novas metodologias para o diagnóstico e identificação de arbovírus podem auxiliar na vigilância epidemiológica e, consequentemente, na prevenção de novos surtos. Objetivo: Este estudo visa realizar a validação de uma metodologia de detecção de 6 diferentes arbovírus através da RT-qPCR. Metodologia: Todos os mosquitos foram coletados no Rio de Janeiro e fotografados em posição anatômica lateral, as asas foram retiradas e armazenadas em lâminas para observação das características anatômicas e morfológicas de importância taxonômica. A extração de RNA e DNA foi realizada utilizando beads SPRI no aparelho de extração automatizado (DNA and RNA Extrator, Loccus). Foram utilizados primers da literatura para os 6 gêneros de interesse, porém, adicionando os adaptadores Illumina nas extremidades, com intuito de já deixar essas amostras encaminhadas para o sequenciamento. Foi feita a utilização de parâmetros positivos na análise de detecção dos gêneros virais selecionados. A reação foi realizada com 4 µL de amostra e controle positivo previamente padronizado usando o kit GoTaq 1-Step RT-qPCR System da Promega conforme manual de instruções, a RT-qPCR foi realizada no aparelho QuastStudio3. As amostras de mosquitos que apresentaram positividade para a detecção de algum dos arbovírus seguiram para confirmação por sequenciamento NGS em uma flow cell Nano no aparelho MiSeq da Illumina. Resultados: Foram coletados na cidade do Rio de Janeiro 343 mosquitos em quatro diferentes parques ecológicos: Parque Chico Mendes, Parque Laje, Campo de Santana e Quinta da Boa Vista. Após a extração de DNA e RNA, foi realizada a análise por RT-qPCR para os 6 diferentes gêneros virais, nos quais pudemos observar que 225 mosquitos (65.6% dos mosquitos coletados) não estavam infectados por nenhuma das arboviroses investigadas, 117 foram positivos para Flavivirus (34% dos mosquitos coletados) e 1 mosquito positivo para Nairovirus (0.3% dos mosquitos coletados). Somente essas amostras positivas seguiram para sequenciamento Illumina, o qual teve um número de bases sequenciadas que passaram pelo filtro de 437.08 Mbp, com porcentagem dessas bases com uma pontuação de qualidade de 30 ou mais (%Q≥ 30) de 65.98%, e porcentagem de clusters passando pela filtragem (%PF) de 92.47%. Discussão: Nossos resultados corroboram em parte com os dados das principais arboviroses na região, uma vez que mostraram uma maior prevalência de vírus do gênero Flavivirus nos mosquitos coletados, os quais causam dengue, febre amarela e Zika. Não há evidências documentadas de transmissão local de Nairovirus no Rio de Janeiro, porém, tivemos a detecção desse vírus em um mosquito coletado. O controle vetorial, embora seja o método de escolha no combate às arboviroses, é difícil de ser realizado devido à alta taxa de reprodução dos mosquitos e sua grande capacidade de adaptação, por isso, é de extrema importância o monitoramento e identificação dos arbovírus circulantes em uma região