Potencial biotecnológico da fração proteica F1 do látex natural e da estimulação elétrica na diferenciação osteogênica de células tronco mesenquimais para o reparo do tecido ósseo
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Data
2024-03-08
Autores
Orientador
Santiago, Patrícia Soares 
Coorientador
Caetano, Guilherme Ferreira
Pós-graduação
Biotecnologia - IQAR 33004030077P0
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
Com o aumento da expectativa de vida e do envelhecimento ósseo, a carência de novas alternativas terapêuticas para casos de fraturas e perdas ósseas críticas ganha relevância. A engenharia tecidual emerge para promover o reparo de tecidos lesados por meio de células e fatores biológicos. O objetivo deste estudo foi realizar a caracterização físico-química da fração proteica F1 do látex natural da seringueira Hevea brasiliensis (LXHb) e avaliar in vitro a proliferação e diferenciação de células tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea de ratos Wistar, submetidas à estimulação elétrica (ES) e cultivadas com a fração proteica F1, bem como analisar a expressão dos genes relacionados à osteogênese. A caracterização foi realizada por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Potencial Zeta para F1 a 1% (10 mg/mL); 0,1% (1 mg/mL) e 0,01% (0,1 mg/mL) a 0, 24 e 48h após diluição em tampão fosfato-salino (pH 7,4). Para F1 a 0,01%, foram feitas análises em diferentes valores de pH, na ausência e na presença de cloreto de sódio (NaCl). Para caracterização das proteínas de F1, foram realizadas Cromatografia Líquida de Gel Filtração (CGF) e Quantificação Proteica por Analisador Elementar CNS - Leco. Nos ensaios de viabilidade celular (método MTT) e de diferenciação osteogênica (vermelho de Alizarina), a estimulação foi aplicada por 60s, 150s e 300s a 10 μA, duas vezes por semana, e o meio celular foi suplementado com as três concentrações de F1. Para as análises de expressão gênica, as células foram estimuladas por 60s e 300s e suplementadas com F1 a 0,1% e 0,01%. Por DLS, observou-se duas populações de partículas independente do tempo de preparo das amostras. Por intensidade a 0h pós preparo, as partículas apresentaram tamanho médio de 123,2 e 5227,0 nm (F1-1%), 164,2 e 1187,0 nm (F1-0,1%), 336,0 e 3369,0 nm (F1-0,01%). O Potencial Zeta apresentou valor nulo para as concentrações analisadas em pH 7,4. A quantificação proteica determinou um teor de 10,2% de proteínas na massa total da fração F1 do látex. Nos ensaios in vitro, observou-se, em todos os grupos experimentais, viabilidade celular acima de 70% (não citotoxicidade) e diferenciação osteogênica superior a 80%, com maior taxa no grupo ES-60s associado à F1 a 0,01% Na análise da expressão gênica, os genes Bmp2 e Ltype apresentaram expressão maior nos grupos estimulados por 60s nas duas associações com F1-0,1% e 0,01%, já o gene Col1a1 obteve expressão significativa no grupo 300s-0,1%. Os genes Alp e Runx2 demonstraram expressão maior na associação com F1-0,01% e o gene Camk2 nos grupos F1-0,1%, ambos associados à ES-60s e 300s. Conclui-se que a fração proteica F1 é um sistema polidisperso e apresenta carga nula em pH 7,4. Essa fração é constituída, em massa, por uma baixa porcentagem de proteínas, porém, com importante ação biológica no que se refere ao aumento da proliferação e diferenciação osteogênica de CTMs, principalmente, quando associada à estimulação elétrica, tornando-a uma alternativa de tratamento promissor para a medicina regenerativa no estudo do reparo ósseo.
Resumo (inglês)
With increased lifespan and bone aging, there is a relevant need for new therapeutic options for fractures and critical bone losses. Tissue engineering emerges to promote injured tissue repair thorough cells and biological factors. This study aimed to perform the physicochemical characterization of the F1 protein fraction from natural rubber (latex) found in the rubber tree Hevea brasiliensis (LXHb), and an in vitro assessment of the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) derived from Wistar rats’ bone marrow subjected to electrical stimulation (ES) and cultured with F1 protein fraction, as well as analyzing the gene expression related to osteogenesis. The characterization was performed by Dynamic Light Scattering (DLS) and Zeta Potential for F1 at 1% (10 mg/mL); 0.1% (1 mg/mL) and 0.01% (0.1 mg/mL), at 0, 24. 48 hours after dilution in phosphate-buffered saline (pH 7.4). Different analyzes were carried out for F1 at 0.01% at different pH values, in the presence or absence of sodium chloride (NaCl). Gel filtration chromatography and Protein Quantification Leco CNS analyzer were used for F1 protein characterization. In the analysis of cell viability (MTT Assay) and osteogenic differentiation (Alizarin red) the stimulation was applied by 60s, 150s, and 300s at 10 μA twice a week, and the cell culture was supplemented with three F1 concentrations. For gene expression analyses, the cells were stimulated by 60s and 300s and supplemented with F1 at 0.1% and 0.01%. By using DLS, two populations of particles were observed regardless of the time for sample preparation. By intensity at 0h after preparation, the particles had an average size of 123.2 and 5227.0 nm (F1-1%), 164.2 and 1187.0 nm (F1-0.1%), 336.0 and 3369.0 nm (F1-0.01%). The Zeta Potential reported null charge for analyzed concentrations at pH 7,4. Protein quantification determined a protein content of 10,2% of in the total mass of the F1 latex fraction. in vitro assays, it was possible to observe in all experimental groups cell viability above 70% (non-cytotoxicity) and osteogenic differentiation above 80% with a higher rate in the ES-60s group associated with F1 at 0,01%. In the gene expression analysis, the Bmp2 and Ltype genes showed a higher rate in the groups stimulated for 60s in both associations with F1-0,1% and 0,01%. As to the Col1a1 gene, a significant rate was obtained in the 300s-0,1% group. Alp e Runx2 genes showed a higher rate in association with F1-0,01% and the Camk2 gene in the F1-0,1% groups, both associated with ES-60s and 300s. In conclusion, the F1 protein fraction is a polydisperse system and shows a null charge at pH 7,4. This fraction consists, in total, of a low percentage of proteins, however, with an important biological action regarding the increase of the proliferation and osteogenic differentiation of MSCs, especially when associated with electrical stimulation, making it an option for a promising treatment in regenerative medicine and bone repair studies.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português