Modificação e caracterização de eletrodos de baixo custo com material derivado de ácido 3-amino-4-hidroxibenzóico visando o desenvolvimento de genossensor aplicado ao diagnóstico do Zika vírus
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Data
2019-02-27
Autores
Orientador
Sotomayor, Maria del Pilar Taboada 
Coorientador
Pós-graduação
Biotecnologia - IQ
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
O vírus Zika é um agente causador de doenças infecciosas que se espalha nos seres humanos através dos vetores do vírus, os mosquitos Aedes aegypti e Aedes albopictus. A transmissão durante a gravidez leva à microcefalia em recém-nascidos e também outros defeitos de nascimento. Os esforços para monitorar e controlar a infecção pelo Zika vírus globalmente são muito limitados. No contexto do desenvolvimento de novas metodologias de diagnóstico, a construção de sensores biológicos tem se tornado uma atividade ampla no ramo da ciência. Neste sentido eletrodos modificados com polímeros condutores e não condutores são opções viáveis, pois além de auxiliar na imobilização das biomoléculas podem melhorar a resposta analítica. Assim, realizou-se, o estudo das propriedades elétricas e morfológicas de um novo material derivado do monômero ácido 3-amino-4- hidroxibenzóico (AAHB) sobre a superfície de eletrodos de grafite de lapiseira para construção de um biossensor contendo uma sequência de oligonucleotídeo específica do Zika vírus. Foi formado um material eletroquimicamente ativo na superfície dos eletrodos de grafite de lapiseira. Analisou-se diferentes condições de eletropolimerização e comportamentos físico-químicos do monômero e foi proposto um mecanismo de formação do polímero. Vários parâmetros foram investigados para otimizar a resposta do genossensor ao substrato utilizando a voltametria de onda quadrada (VOQ). Dentre essas investigações, as melhores respostas foram obtidas, e o sensor mostrou uma faixa linear de trabalho para a sequência sintética de 14 x10 - 6 a 66 x10-6 mol L-1 (r2 = 0,996), sendo a equação obtida da regressão linear: ∆ip (µA) = 43,34+1,38x[cDNA] (µmol L-1 ) com limite de detecção de 2,3 x10-6 mol L-1 e o limite de quantificação de 7,6 x10 – 6 mol L-1 , respectivamente. A faixa linear de trabalho obtida em amostras de soro humano enriquecidas com material genético extraído do Zika vírus foi entre 84,0 pmol L-1 a 1410,0 pmol L-1 (r2= 0,997). A equação obtida da regressão linear foi: Δip (μA) = (-7.14) + 0,195x [cDNA] (pmol L – 1 ) sendo o limite de detecção 25,4 x10-12 mol L-1 e o limite de quantificação de 84,0 x 10- 12 mol L - 1 . Os eletrodos foram armazenados a -8 °C por 30 dias e não foi observada uma perda de resposta significativa do material. Adicionalmente, o sistema se mostrou seletivo na presença de um alvo não-complementar e em amostras de soro humano enriquecidas com material genético extraído do Dengue vírus tipo 2 (DENV-2) e tipo 3(DENV-3). Assim, o sistema mostra-se promissor no desenvolvimento de genossensor para diagnóstico do Zika vírus, com a utilização do poli(AAHB) como suporte para imobilização de biomoléculas em eletrodos de grafite de lapiseira, que foram escolhidos pela eficiência e baixo custo. Uma segunda alternativa avaliada foi o uso de polímeros molecularmente impressos (MIP) e seus controles não impressos (NIP) para biotina. Neste caso, utilizando DNA-biotinilado das sequências sintéticas do genoma do vírus Zika em imunoensaios de ELISA, nos que se avaliou a capacidade de reconhecimento do material, para posteriormente aplicar estes polímeros em ensaios de Fluxo Lateral, os quais apresentaram boa resposta no reconhecimento seletivo. Mostrando que este sistema é uma alternativa promissora para a rápida detecção do Zika vírus.
Resumo (inglês)
The Zika virus is a causative agent of infectious diseases that spreads in humans through the virus vectors, Aedes aegyptiand Aedes albopictusmosquitoes. Transmission during pregnancy leads to microcephaly in newborns and also other birth defects. Efforts to monitor and control Zika virus infection globally are very limited. In the context of the development of new diagnostic methodologies, the construction of biological sensors has become a broad activity in the field of science. In this sense, electrodes modified with conductive and non-conductive polymers are viable options, since besides aiding in the immobilization of the biomolecules they can improve the analytical response. Thus, the study of the electrical and morphological properties of a new material derived from the 3-amino-4-hydroxybenzoic acid monomer (AHBA) on the surface of graphite graphite electrodes was carried out to construct a biosensor containing an oligonucleotide sequence specific Zika virus. An electrochemically active material was formed on the surface of the graphite graphite electrodes. It was analyzed the sedimentation conditions of electropolymerization and physicochemical behavior of the monomer and a mechanism of formation of the polymer was proposed. Several parameters were investigated to optimize the response of the genosensor to the substrate using square wave voltammetry (SWV). Among these investigations, the best responses were obtained, and the sensor showed a linear working range for the synthetic sequence of 14 x10-6 to 66 x10-6mol L-1(r2= 0.996), and the equation was obtained from the linear regression : Δip (μA) = 43.34 + 1.38x [cDNA] (μmol L-1) with detection limit of 2.3 x 10-6mol L-1and the quantification limit of 7.6 x 10-6 mol L-1, respectively. The linear range of work obtained on human serum samples enriched with genetic material extracted from the Zika virus was between 84.0 pmol L-1and 1410.0 pmol L-1(r2= 0.997). The equation obtained from the linear regression was: Δip (μA) = (-7.14) + 0.195x [cDNA] (pmol L -1), the detection limit being 25.4 x 10-12molL-1and the limit of quantification 84.0 x 10-12mol L-1. The electrodes were stored at -8°C for 30 days and no significant loss of response of the material was observed. In addition, the system was selective in the presence of a non-complementary target and in human serum samples enriched with genetic material extracted from Dengue virus type 2(DENV-2) and type 3 (DENV-3). Thus, the system is promising in the development of a genosensor for the diagnosis of the Zika virus, with the use of poly (AHBA) as a support for the immobilization of biomolecules in pencil graphite electrodes, which were chosen for efficiency and low cost. A second alternative evaluated was the use of molecularly printed polymers (MIP) and its non-printed controls (NIP) for biotin. In this case, using biotinylated DNA from the synthetic sequences of the Zika virus genome inELISA immunoassays, in which the recognition ability of the material was evaluated, and later applied these polymers in lateral flow assays, which presented good response in selective recognition. Showing that this system is a promising alternative for the rapid detection of the Zika virus.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português