Recombinant phospholipase A1 from Polybia paulista wasp venom for molecular diagnosis of allergy

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dc.contributor.advisorBraga, Márcia Regina Brochetto [UNESP]
dc.contributor.advisorLasa, Alexis Musacchio [UNESP]
dc.contributor.authorPérez-Riverol, Amilcar [UNESP]
dc.contributor.institutionUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.date.accessioned2017-09-29T19:46:00Z
dc.date.available2017-09-29T19:46:00Z
dc.date.issued2017-09-22
dc.description.abstractA fosfolipase A1 é um dos principais alérgenos identificados no veneno do Polybia paulista (Hymenoptera: Vespidae), uma vespa social de elevada importância clínica no sudeste do Brasil. A produção recombinante deste alérgeno contribuirá com o desenvolvimento do diagnóstico molecular de alergia. Neste trabalho é descrita a produção recombinante da fosfolipase A1 de P. paulista (rPoly p 1) no sistema celular Escherichia coli. Elevados níveis da rPoly p 1 na forma insolúvel foram obtidos após expressão na bactéria. A otimização das condições de solubilização permitiu incrementar os níveis de recuperação do alérgeno recombinante. A rPoly p 1 foi purificada (99%) até homogeneidade mediante cromatografia de afinidade em coluna de Ni2+, mostrando valores de rendimento finais de 1.5 g/L de meio de cultura. A forma nativa do alérgeno (nPoly p 1) foi purificada mediante cromatografia de troca catiônica. A rPoly p 1 foi reconhecida pela IgE específica de soros de pacientes sensibilizados ao veneno de P. paulista. O uso da rPoly p 1 permite diferenciar a ocorrência de real dupla sensibilização ao veneno de vespa e formiga ou vespa e abelha da incidência de reatividade cruzada. Soros de pacientes com IgE específica ao veneno de abelha e formiga não reagiram com a rPoly p 1, enquanto que soros de camundongos sensibilizados com rPoly p 1 apresentaram reatividade cruzada exclusivamente com fosfolipases A1 (PLA1) de vespas Neotropicais ou de climas temperados. O alinhamento múltiplo do modelo 3-D da rPoly p 1 sugere que a base molecular desta reatividade é a presença de epitopos lineares e conformacionais compartilhados pelas PLA1s das espécies avaliadas. A presença de CCDs no veneno de varias espécies de vespas Neotropicais foi também analisada. Os resultados apresentados nesta Tese indicam que a rPoly p 1 pode ser utilizada no diagnostico molecular de alergia a veneno de P. paulista. O uso da rPoly p 1 ira a melhorar à identificação específica de veneno responsável pela sensibilização primaria e por tanto o desenho da imunoterapia.pt
dc.description.abstractPhospholipase A1 (PLA1) is one of the major allergens identified in the venom Polybia paulista (Hymenoptera: Vespidae), a clinically relevant social wasp from Brazil Southeast. The recombinant production of this allergen could result in the development of molecular diagnosis of allergy thus improving the outcomes of venom immunotherapy (IT). Here, we describe the heterologous production of the PLA1 from P. paulista venom in Escherichia coli. High levels of the insoluble recombinant allergen (rPoly p 1) were obtained after expression in the prokaryotic system. The downstream optimization of the solubilization process resulted in high levels of protein recovery. The rPoly p 1 was purified to homogeneity (99%) using an immobilized Ni2+ metal affinity chromatography while a single-step cation-exchange chromatography allowed the purification of native Poly p 1 (nPoly p 1) from the venom glands. Immunoblotting analyses showed the IgE-mediated recognition of the rPoly p 1 by sera from patients sensitized to P. paulista venom. The rPoly p 1 could allow the differentiation of true double sensitization to wasp/bee and wasp/ant venoms from cross-reactivity. The sera from patients with monosensitization to honey bee or fire ant venoms do not cross-reacted with the recombinant allergen. Meanwhile, the sera from rPoly p 1-sensitized mice cross-reacted with venoms of other clinically relevant wasps from Neotropical and temperate regions. The alignment of the 3-D model from rPoly p 1 with the PLA1s from some of these wasps suggested the presence of homologues epitopes as the molecular basis for the cross-reactivity. The presence of cross-reactive carbohydrates determinants (CCDs) in the venom of several Brazilian wasps, which is a major issue for understanding the incidence of cross-reactivity during diagnosis, was also analyzed. Overall, the results described in this work suggest that rPoly p1 is a feasible candidate for the rational design of molecular diagnosis of P. paulista venom allergy. The use of rPoly p 1 will allow the identification of the primary sensitizing insect thus leading to a significant improvement in the outcomes of the venom immunotherapy.en
dc.description.sponsorshipConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
dc.description.sponsorshipCoordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
dc.description.sponsorshipFundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)
dc.description.sponsorshipIdCAPES-DS: 1257664
dc.description.sponsorshipIdCAPES-PDSE: 88881.132448/2016-01
dc.description.sponsorshipIdFAPESP: 2014/13936-7
dc.description.sponsorshipIdCNPq: 455422/2014-1
dc.identifier.aleph000892595
dc.identifier.capes33004137046P4
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11449/151777
dc.language.isoeng
dc.publisherUniversidade Estadual Paulista (Unesp)
dc.rights.accessRightsAcesso aberto
dc.subjectPolybia paulistapt
dc.subjectFosfolipase A1 recombinantept
dc.subjectSensibilicaçãopt
dc.subjectReatividade cruzadapt
dc.subjectIgE específicapt
dc.subjectRecombinant phospholipase A1en
dc.subjectSensitizationen
dc.subjectCrossreactivityen
dc.subjectSpecific IgEen
dc.titleRecombinant phospholipase A1 from Polybia paulista wasp venom for molecular diagnosis of allergyen
dc.title.alternativeFosfolipase A1 recombinante do veneno da vespa P. paulista para o diagnóstico molecular de alergiapt
dc.typeTese de doutorado
unesp.campusUniversidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claropt
unesp.embargo24 meses após a data da defesapt
unesp.graduateProgramCiências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) - IBRCpt
unesp.knowledgeAreaBiologia celular e molecularpt
unesp.researchAreaBiologia Molecular e Estruturalpt

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