Avaliação de peróxidos orgânicos biológicos como inibidores da enzima AhpC e seus efeitos sobre a sobrevivência de Pseudomonas aeruginosa
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Data
2024-12-09
Autores
Orientador
Oliveira, Marcos Antonio de 
Coorientador
Cabrera, Vitoria Isabela Montanhero
Pós-graduação
Curso de graduação
São Vicente - IBCLP - Ciências Biológicas
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Trabalho de conclusão de curso
Direito de acesso
Acesso restrito
Resumo
Resumo (português)
O aumento de linhagens de bactérias resistentes a múltiplas drogas (MDR - Multiple Drug Resistance) é uma preocupação para a saúde pública global. Os antibacterianos utilizados para o combate de bactérias patogênicas interferem em processos biológicos específicos, no entanto, diferentes classes possuem um mecanismo comum que auxilia na erradicação dos patógenos, a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Células de defesa de eucariotos superiores também produzem elevadas quantidades de EROs e adicionalmente espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (conjuntamente denominadas ERONs) como uma das principais frentes de defesa contra organismos patogênicos. Dentre as diferentes espécies formadas, os peróxidos representam uma classe importante, pois apesar de possuírem baixa reatividade, podem atravessar ou reagir com as membranas biológicas e reagir com outros tipos de ERONs, gerando espécies bastante tóxicas capazes de causar danos a todas as classes de biomoléculas. Neste contexto, enzimas antioxidantes, em especial as peroxidases, desempenham papel importante na sobrevivência dos patógenos e podem ser alvos de grande importância para a busca de inibidores que auxiliem no combate a estes microrganismos, uma vez que a aniquilação de sua atividade tem efeitos pronunciados na mortalidade dos mesmos. A peroxirredoxina (Prx) bacteriana AhpC (Alquil hidroperóxido redutase C) se destaca pela larga distribuição, abundância e elevada variedade de substratos, cujas taxas de decomposição podem atingir constantes de 107 8M-1s-1. As AhpCs são capazes de decompor peróxidos utilizando uma cisteína reativa, denominada de peroxidásica (CP). Já foi demonstrado que sob elevadas concentrações de peróxido de hidrogênio ocorre a perda da atividade peroxidásica de AhpC em razão da hiperoxidação de CP e a enzima é degradada. Recentemente nosso grupo de pesquisa demonstrou que AhpC de Pseudomonas aeruginosa (PaAhpC), uma bactéria Gram negativa que apresenta linhagens MDR envolvidas em infecções hospitalares com elevado índice de mortalidade, possui uma afinidade extraordinária sobre peróxidos de lipídeos de cadeia longa. Ainda, esses peróxidos são capazes de oxidar e promover a hiperoxidação de CP em concentrações diminutas (com consequente inibição irreversível da atividade peroxidásica), com constantes de segunda ordem que atingem taxas de 106M-1s-1 (manuscrito em fase final de elaboração). Estes resultados nos parecem importantes uma vez que já foi demonstrado que AhpC é considerado um fator de virulência nesta espécie. Em plantas e animais, são encontrados peróxidos de lipídeos (em especial endoperóxidos, cuja função peróxido é contida entre dois carbonos em uma estrutura cíclica) envolvidos em processos de sinalização celular e defesa contra patógenos. Trabalhos indicam que endoperóxidos podem inibir tiól proteinas através da ligação do grupo reativo com cisteínas catalíticas. Este projeto teve como objetivos avaliar o efeito de peróxidos de lipídeos de cadeia longa formados no hospedeiro, peróxido de ácido araquidônico (15-HpETE) e prostaglandina G2 (PGG2), e os endoperóxidos natural DBEGH 3.5 (extraído de uma planta nativa brasileira) e sintético arterolane, sobre a atividade peroxidásica/inativação da enzima AhpC de P. aeruginosa como também investigar in vitro o efeito de peróxidos separadamente ou em conjunto com antibióticos em células bacterianas. No que tange aos endoperóxidos simulações de docking molecular indicam que ambos podem ser estabilizados no sítio ativo de PaAhpC com energia livre de Gibbs (ΔG) de -5.8 kcal/mol (DBEGH 3.5) e -7.8 kcal/mol (arterolane). Por meio de técnicas espectrométricas demonstramos que ambos os endoperóxidos provocam alterações na estrutura da proteína. No entanto ensaios bioquímicos revelaram que, de forma contrária ao descrito na literatura, os endoperóxidos podem ser decompostos por PaAhpC. Análises cinéticas revelaram que a reatividade sobre o arterolane é ínfima, no entanto determinação dos parâmetros cinéticos revelaram que o DBEGH 3.5 é decomposto com taxas aparentes similares ao do H2O2 (103M-1s-1). Esta é a primeira vez que é demonstrado que um endoperóxido é decomposto por uma peroxirredoxina e esforços estão sendo feitos parasse determinar o grupo de saída por espectrometria de massas. Os resultados obtidos estão sendo compilados em um manuscrito. Em relação a peróxidos de lipídeos produzidos pelo hospedeiro 15-HpETE e PGG2 durante infecções dados de docking molecular revelaram elevada estabilidade no sítio ativo (ΔG-5.1 e -5.6 kcal/mol, respectivamente) e grande proximidade da função peróxido com CP (3.28 e 3.57 Å). Por meio de ensaios de atividade peroxidásica com Km inferior ao H2O2 (15-HpETE = 54.71, PGG2 = 36.34 e H2O2 =116.45 M-1 respectivamente), indicando alta afinidade pelos substratos lipídicos de humanos, aspecto importante pois pode estar relacionada a subversão das defesas do hospedeiro. Por fim, análises in vitro utilizando as linhagens PA14WT e PA14Dahpc indicam que peróxidos orgânicos podem potencializar a ação de antibióticos.
Resumo (inglês)
The increase in multiple drug-resistant (MDR) strains of bacteria is a concern for global public health. The antibacterials used to combat pathogenic bacteria interfere with specific biological processes; however, different classes share a common mechanism that helps eradicate pathogens: the generation of reactive oxygen species (ROS). Defense cells of higher eukaryotes also produce high amounts of ROS and, additionally, reactive nitrogen species (RNS) (collectively called RONS), which are one of the main lines of defense against pathogenic organisms. Among the different species formed, peroxides represent an important class. Although they have low reactivity, they can cross or react with biological membranes and interact with other types of RONS, generating very toxic species capable of causing damage to all classes of biomolecules. In this context, antioxidant enzymes, especially peroxidases, play an important role in the survival of pathogens and can be very important targets in the search for inhibitors to help combat these microorganisms, since the annihilation of their activity has pronounced effects on their mortality. The bacterial peroxiredoxin (Prx) AhpC (alkyl hydroperoxide reductase C) stands out for its wide distribution, abundance, and high variety of substrates, with decomposition rates that can reach constants of 107-8 M−1s−1. AhpCs are capable of decomposing peroxides using a reactive cysteine (CP). It has been shown that, under high concentrations of hydrogen peroxide, AhpCs lose their peroxidase activity due to CP hyperoxidation, leading to enzyme degradation. Recently, our research group demonstrated that AhpC from Pseudomonas aeruginosa (PaAhpC), a Gram-negative bacterium with MDR strains involved in hospital infections and a high mortality rate, has an extraordinary affinity for long-chain lipid peroxides. Furthermore, these peroxides are capable of oxidizing and promoting the hyperoxidation of CP at low concentrations, with consequent irreversible inhibition of peroxidase activity, and second-order constants that reach rates of 106 M−1s−1 (manuscript in final draft). These results are significant, as AhpC has already been shown to be a virulence factor in this species. In plants and animals, lipid peroxides (especially endoperoxides, whose peroxide function is contained between two carbons in a cyclic structure) are involved in cell signaling processes and defense against pathogens. Recent works indicate that endoperoxides can inhibit thiol proteins by binding the reactive group to catalytic cysteines. This project aimed to evaluate the effect of long-chain lipid peroxides formed in the host, including arachidonic acid peroxide (15-HpETE) and prostaglandin G2 (PGG2), as well as the natural endoperoxides DBEGH 3.5 (extracted from a native Brazilian plant) and synthetic arterolane, on the peroxidase activity/inactivation of the AhpC enzyme of P. aeruginosa, and to investigate in vitro the effect of these peroxides, separately or in combination with antibiotics, on bacterial cells. Regarding endoperoxides, molecular docking simulations indicate that both can be stabilized in the active site of PaAhpC with Gibbs free energy (ΔG) values of -5.8 kcal/mol (DBEGH 3.5) and -7.8 kcal/mol (arterolane). Using spectrometric techniques, we demonstrated that both endoperoxides cause alterations in protein structure. However, biochemical tests revealed that, contrary to what has been described in the literature, endoperoxides can be reduced by PaAhpC. Kinetic analyses revealed that the reactivity of arterolane is minimal; however, determination of the kinetic parameters showed that DBEGH 3.5 is decomposed with apparent rates similar to that of H2O2 (103 M−1s−1). This is the first time that an endoperoxide has been shown to be decomposed by a peroxiredoxin, and efforts are being made to determine the leaving group by mass spectrometry. The results obtained are being compiled into a manuscript. Regarding lipid peroxides produced by the host, 15-HpETE and PGG2 during infections, molecular docking data revealed high stability in the active site (ΔG of -5.1 and -5.6 kcal/mol, respectively) and great proximity of the peroxide function to CP (3.28 and 3.57 Å). Results obtained through peroxidase activity assays show a lower Km than H2O2 (15-HpETE = 54.71, PGG2 = 36.34, and H2O2 = 116.45 M−1, respectively), indicating a high affinity for human lipid substrates—an important aspect, as this may be related to the subversion of host defenses. Finally, in vitro analyses using the PA14WT and PA14∆ahpc strains indicate that organic peroxides can potentiate the action of antibiotics.
Descrição
Palavras-chave
Idioma
Português
Como citar
SILVA, Laura Fernandes da . Avaliação de peróxidos orgânicos biológicos como inibidores da enzima AhpC e seus efeitos sobre a sobrevivência de Pseudomonas aeruginosa. 2024. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biológicas com habilitação em Biologia Marinha) – Instituto de Biociências do Campus do Litoral Paulista, Universidade Estadual Paulista, São Vicente, 2024.
