Caracterização molecular do Vírus da Anemia Infecciosa Equina do Pantanal e padronização de qPCR para diagnóstico
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Data
2019-02-22
Autores
Orientador
Araujo Junior, João Pessoa 
Coorientador
Pós-graduação
Biotecnologia - IBB
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Tese de doutorado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
O Vírus da Anemia Infecciosa Equina (VAIE) é um lentivírus que infecta equídeos causando a Anemia Infecciosa Equina. A doença possui distribuição mundial e o principal método de controle empregado é a eutanásia dos animais positivos, uma vez que não existe cura ou vacina disponível. No Brasil, a região do Pantanal é endêmica para a doença e, somente nessas áreas, a eutanásia não é obrigatória. A alta variação genética de lentivírus durante uma infecção prolongada é bem conhecida em várias espécies e também descrita em sequências de VAIE de outros países. Não há sequência genômica brasileira completa descrita ou mesmo um estudo da variação genética do vírus em um ambiente endêmico como o Pantanal Brasileiro. Com isso, este trabalho teve como objetivos a caracterização molecular do VAIE em equinos da região do Pantanal Brasileiro, e a padronização da PCR quantitativa (qPCR) para detecção do DNA proviral de VAIE. Duas amostras de plasma equino positivas para VAIE foram submetidas ao sequenciamento do genoma completo utilizando uma combinação de técnicas tradicionais e de nova geração. O genoma a partir do RNA viral foi obtido, anotado e comparado com sequências virais obtidas de animais naturalmente infectados em outros países. As sequências provenientes do Pantanal apresentaram identidade entre 75 e 77 % com sequências de outros países e 88,54 % entre si, classificando-as em um clado individual na árvore filogenética dos vírus já descritos, exibindo a maior variação genética descrita entre sequências de um mesmo país. Com a análise do gene do envelope viral, observou-se que os dois animais estudados estavam infectados por diferentes quasispécies virais. Baseado nas sequências obtidas, um qPCR foi padronizado para amplificar 71pb do gene tat de VAIE. A técnica foi testada em 255 amostras de DNA total de equinos do Pantanal e comparada com os resultados obtidos em testes sorológicos (IDGA e ELISA) e uma Semi Nested PCR. A qPCR apresentou melhor sensibilidade, especificidade e alta correlação com os resultados da Semi Nested PCR, sendo ainda um teste com menor risco de contaminação e melhor praticidade. A qPCR detectou o mesmo número de amostras positivas que o padrão ouro IDGA, porém ambos detectaram amostras diferentes, confirmadas por sequenciamento. Um fluxograma diagnóstico foi proposto para diminuir o risco de falsos negativos em áreas endêmicas, com o uso de IDGA, seguido de ELISA e qPCR.
Resumo (inglês)
Equine infectious anemia virus (EIAV) is a lentivirus that infects equids and causes equine infectious anemia (EIA). This disease presents worldwide distribution and the main control method is the euthanasia of positive animals, since there is no cure or vaccine available. The Pantanal region in Brazil is endemic for the disease, and euthanasia is not mandatory in this area. The high lentivirus genetic variation during a prolonged infection is well known in several species and also described in EIAV sequences in other countries. There are no Brazilian viral genomic sequences available or even a study of genetic variation in an environment such as Brazilian Pantanal. This work aimed to characterize the EIAV complete genome in equines from Brazilian Pantanal and to standardize a quantitative real time PCR (qPCR) for detection of EIAV proviral DNA. Two plasma samples of EIAV positive horses were submitted to massive sequencing by combination of Sanger and NGS sequencing. The complete genome from viral RNA was obtained, annotated and compared with viral sequences of naturally infected animals from other countries. Sequences from Pantanal showed identity between 75% and 77% with other countries sequences and 88.54% with each other, classifying them into an individual cluster in EIAV cladogram and exhibiting the greatest genetic variation between sequences from the same country. With viral envelope gene analysis, both Brazilian sequences were classified as two quasispecies. A qPCR based on the sequences obtained was standardized to amplify 71 bp of tat gene of EIAV. This technique was tested in 255 equine total DNA from Pantanal and compared with results of serological tests (AGID and ELISA) and a Semi Nested PCR. Quantitative PCR presented better sensitivity, specificity and high correlation with Semi Nested PCR results, still considered a test with lower risk of contamination and better practicality. The qPCR detected the same number of positive samples as the gold standard AGID, but both detected different samples, confirmed by sequencing. A diagnosis flowchart was proposed to decrease false-negative risks in endemic áreas, using a sequence of AGID, ELISA and qPCR.
Descrição
Idioma
Português