Impacto da diacereína sobre citocinas envolvidas na formação e reabsorção óssea na periodontite induzida em molares de rato.

Abstract

Diversos agentes bioativos como interleucinas (IL), metaloproteinases da matriz e fatores de transcrição que estimulam a osteoclastogênese e inibem diferenciação de osteoblastos. A diacereína é um anti-inflamatório usado no tratamento de osteoartrite, cuja fisiopatologia é similar à periodontite. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da diacereína sobre as citocinas envolvidas na formação e atividade de osteoclastos do osso alveolar de ratos com periodontite. Além disso, foi investigado se a diacereína interfere na diferenciação de osteoblastos. Foram utilizados 108 ratos Holtzman, distribuídos nos grupos GPD (grupo com periodontite e tratado com 100mg/kg de diacereína), GPS (grupo com periodontite e tratado com solução salina) e GC (Grupo controle, periodonto saudável sem qualquer tratamento). A periodontite foi induzida por ligadura no 1º molar superior direito. Após 7 dias, a ligadura foi removida e o tratamento foi iniciado. Os animais foram eutanasiados após 7, 15 e 30 dias do início do tratamento. Cortes foram corados com tricrômico de Gomori para análise morfológica ou submetidos às reações imuno-histoquímicas/imunofluorescência para detecção da fosfatase alcalina (ALPase), F4/80 (fagócitos mononucleares) e caspase-3, e ao método do TUNEL. As características ultraestruturais dos osteoclastos também foram avaliadas. Amostras de mucosa gengival foram coletadas para análise da expressão gênica de Tnf, Il1b, Tnfsf11 e Tnfrsf11b por RT-qPCR. Os dados foram submetidos ao Two-way ANOVA e pós-teste de Tukey. A análise de expressão gênica foi realizada por meio do método ΔΔCT para quantificação relativa, e submetidos ao One-way ANOVA. O nível de significância considerada foi p<0,05. Espécimes do GPD e GPS mostraram evidente processo inflamatório na mucosa gengival com aumento significante de macrófagos F4/80. Nas amostras gengivais do GPD, a expressão dos genes Tnf, Il1b e Tnfsf11 reduziram significantemente em comparação ao GPS, com exceção da expressão de Tnf aos 7 dias. Houve também uma redução na razão Tnfsf11/Tnfrsf11b (RANKL/OPG) no grupo GPD. Os espécimes do GPD exibiram frequência de osteoclastos TUNEL-positivos significantemente maior em comparação ao GPS (p<0,0001) e GC (p<0,0001), em todos os períodos. Osteoclastos com citoplasma fortemente imunofluorescente à caspase-3 e com núcleos exibindo massas irregulares com conspícua cromatina condensada foram também observados nos espécimes do GPD, confirmando a morte de osteoclastos por apoptose. Em todos os períodos, os espécimes do GPD apresentaram um significante aumento no número de osteoblastos ALPase-positivos em comparação ao GPS. Os nossos resultados sugerem que a diacereína inibe a formação de osteoclastos por meio da redução dos níveis de RNAm de Tnf e Il1b que culminou na redução da razão Tnfsf11/Tnfrsf11b e também induziu apoptose em osteoclastos do processo alveolar de molares com periodontite. Além, o significante aumento de ALPase nos osteoblastos do GPD aponta para um papel da diacereína na diferenciação de osteoblastos.

Several bioactive agents such as interleukins (IL), matrix metalloproteinases, and transcription factors that stimulate osteoclastogenesis and inhibit osteoblastic differentiation are involved in the progression of periodontitis. Diacerein is an anti-inflammatory used in the treatment of osteoarthritis, whose pathophysiology is similar to periodontitis. The aim of the study was to evaluate the effects of diacerein on cytokines involved in the formation and activity of alveolar bone osteoclasts in rats with periodontitis. Moreover, it was investigated whether diacerein interferes with osteoblast differentiation. A total of 108 Holtzman rats were distributed into PDG (periodontitis group treated with 100mg/kg diacerein), PSG (periodontitis group treated with saline solution), and CG (control group, healthy periodontium without any treatment). Periodontitis was induced by ligature on the upper right first molar. After 7 days, the ligature was removed, and the treatment was initiated. The animals were euthanized after 7, 15, and 30 days from the beginning of the treatment. Sections were stained with Gomori's trichrome for morphological analysis or subjected to immunohistochemical/immunofluorescence reactions to detect alkaline phosphatase (ALPase), F4/80 (mononuclear phagocytes), and caspase-3, as well as to the TUNEL method. The ultrastructural features of osteoclasts were also evaluated. Gingival mucosa samples were collected for analysis of Tnf, Il1b, Tnfsf11 (RANKL), and Tnfrsf11b (OPG) gene expression by RT-qPCR. Data were subjected to Two-way ANOVA and Tukey's post-test. Gene expression analysis was performed using the ΔΔCT method for relative quantification and submitted to One-way ANOVA. Significance was considered at p<0.05. Specimens from PDG and PSG showed evident inflammatory processes in the gingival mucosa with a significant increase in F4/80 macrophages. In PDG gingival samples, the expression of Tnf, Il1b, and Tnfsf11 genes reduced significantly compared to PSG, except for Tnf expression at 7 days. In the PDG specimens was detected a significant reduction in the mRNA levels of Tnfsf11/Tnfrsf11b ratio, at all time points. PDG specimens exhibited a significantly higher frequency of TUNEL-positive osteoclasts than in PSG (p<0.0001) and CG (p<0.0001) at all time points. Osteoclasts with cytoplasm strongly immunofluorescent for caspase-3 and nuclei displaying irregular masses with conspicuous condensed chromatin were also observed in PDG specimens, confirming osteoclast apoptosis. At all time points, PDG specimens showed a significant increase in the number of ALPase-positive osteoblasts compared to PSG. Our results suggest that diacerein inhibits osteoclast formation by decreasing Tnf and Il1b mRNA levels, resulting in the reduction of the Tnfsf11/Tnfrsf11b (RANKL/OPG) ratio and also induces apoptosis in osteoclasts of molar alveolar processes with periodontitis. Additionally, diacerein possibly stimulates osteoblast differentiation, as there was a significant increase in ALPase in PDG osteoblasts.