Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans

Abstract

Candida albicans é o principal micro-organismo causador de infecções na cavidade bucal e já apresenta resistência aos principais antifúngicos utilizados para tratamento. Os peptídeos da família das Histatinas são moléculas promissoras para esse tratamento, devido a sua forte ação contra C. albicans. Histatina-5 (Hst5), um dos peptídeos dessa família, apresenta ação contra esse micro-organismo, mas sofre rápida degradação em saliva humana. Nesse trabalho foram propostas três novas sequências de peptídeos baseados na Hst5, denominados 8WH5, 7WH5 e 6WH5, e os peptídeos análogos 0WHst5, WP113. Além disso, foram desenvolvidos lipossomas produzidos pela técnica de hidratação do filme lipídico, com objetivo de proteger os peptídeos da degradação salivar. Os peptídeos 0WHst5 e WP113 apresentaram degradação após 1,5 horas em saliva humana. Já os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 foram encontrados na saliva após 8 horas de incubação. Todos os peptídeos apresentaram ação antifúngica, com destaque para o peptídeo 8WH5 que apresentou concentração inibitória mínima (CIM) de 20 µmol L-1 para C. albicans ATCC 90028. Os peptídeos foram eficazes em prevenir a formação de biofilme de C. albicans, mantendo seu crescimento abaixo de 20% em concentrações de 320 e 160 µmol L-1. Os lipossomas vazios apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 80,0 nm e os lipossomas incorporados com os peptídeos apresentaram aumento nesse diâmetro com valores na faixa de 90,0 a 120,0 nm. O potencial zeta das formulações foi negativo, com valores de -11,6 mV para os lipossomas vazios e valores abaixo de -8,7 mV para os lipossomas incorporados com os peptídeos. O índice de polidispersão ficou entre 0,200 e 0,300 para todos os sistemas lipossomais. A eficiência de incorporação (IPD) foi maior de 90% para todos os peptídeos, indicando uma alta incorporação mesmo se tratando de moléculas hidrofílicas. Estudos de microscopia de força atômica (AFM) e de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) indicaram que os peptídeos podem interagir eletrostaticamente com bicamada externa dos lipossomas. Os lipossomas foram mais eficazes do que os peptídeos livres para inibição de biofilmes maduros inibindo seu crescimento com concentração oito vezes menor do que os peptídeos livres. Dessa forma, é possível concluir que os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 são mais resistentes a degradação por proteases salivares e foram eficazes em prevenir a formação de biofilme. Já os sistemas lipossomais, apesar de apresentaram proteção reduzida contra degradação proteolítica dos peptídeos, foram eficazes em inibir biofilmes maduros. Dessa forma, os peptídeos e sistemas lipossomais produzidos nesse trabalho surgem como uma nova estratégia para prevenção de infecções causadas por C. albicans na cavidade bucal.

Candida albicans is the main microorganism that causes infections in the oral cavity and already shows resistance to most antifungals used for treatment. The peptides of the Histatin family are promising molecules for this treatment due to their strong action against C. albicans. Histatin-5 (Hst5), a peptide from the histatin family, has action against this microorganism, but it undergoes rapid degradation in human saliva. In this work, three new peptides based on Hst5 were proposed, called 8WH5, 7WH5 and 6WH5, and the analogous peptides 0WHst5, WP113. In addition, liposomes produced by the thin film hydration technique, were developed in order to protect the peptides from salivary degradation. The 0WHst5 and WP113 peptides showed degradation after 1.5 hours in human saliva. The peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 were found in saliva after 8 hours of incubation. All peptides showed antifungal action, especially peptide 8WH5, which showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 μmol L-1 for C. albicans ATCC 90028. The peptides were effective in preventing C. albicans biofilm formation, maintaining its growth below 20% at concentrations of 320 and 160 μmol L-1. The empty liposomes showed a mean hydrodynamic diameter of 80.0 nm and the liposomes incorporated with the peptides showed an increase in this diameter with values in the range of 90.0 to 120.0 nm. The zeta potential of the formulations was negative, with values of -11.6 mV for empty liposomes and values below -8.7 mV for liposomes incorporated with peptides. The polydispersion index (PDI) was between 0.200 and 0.300 for all liposomal systems. The incorporation efficiency was greater than 90% for all peptides, indicating a high incorporation even in the case of hydrophilic molecules. Atomic force microscopy (AFM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) studies indicated that peptides can interact electrostatically with the outer bilayer of liposomes. Liposomes were more effective than free peptides for inhibiting mature biofilms, inhibiting their growth at eight times lower concentration than free peptides. Thus, it is possible to conclude that peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 are more resistant to degradation by salivary proteases and were effective in preventing biofilm formation. Liposomal systems, despite showing reduced protection against proteolytic degradation of peptides, were effective in inhibiting mature biofilms. Thus, the peptides and liposomal systems produced in this work emerge as a new strategy to prevent infections caused by C. albicans in the oral cavity.